一、实验目的

    掌握氯化三苯四氮唑(TTC)法测定牛乳中抗生素残留的原理和方法。

    二、实验原理

    本法以氯化三苯四氮唑(TTC)作为抗生素残留量测定的指示剂。当乳中加入嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)后，如果乳中不含抗生素，则嗜热链球菌生长繁殖，可将无色的氧化型TTC变为红色的还原型TTC，所以乳变红色。相反，如果乳中有抗生素存在，则嗜热链球菌不能生长繁殖或生长繁殖受到抑制，无色氧化型的1vrC不能转化成红色还原型的TTC，乳不变色。

    三、仪器与试材

    1．仪器与器材

    恒温培养箱、恒温水浴锅等。

    2．菌种

    嗜热乳酸链球菌(Streptococcus thermophilus)。

    3．试剂与溶液

    TTC溶液(4％)：称取1g TTC，溶于5mL灭菌蒸馏水中，装入褐色无菌瓶内于4℃避光保存，临用时用无菌蒸馏水稀释5倍。如遇溶液变为黄色或淡褐色，则不能再用，需重新配制。

    4．实验材料

    2～3种鲜乳，各50mL。

    四、实验步骤

    1．菌液的制备    

    将菌种接种于灭菌脱脂乳(113℃无菌20rain)中，于(36±1)℃培养15h后，以灭菌脱脂乳1：1稀释，待用。

    2．样品测定

    (1)取鲜乳液样品9mL置于试管(18mm×180mm)中，80℃水浴加热5min，取出冷却至36℃。

    (2)加入菌液1mL于乳液中，于(36±1)℃水浴培养2h后，再加0.3mL TTC溶液，(36±1)℃水浴培养30min后，观察颜色变化。

    (3)如果样品变为红色，则表明抗生素残留为阴性；如果样品颜色不变，则应于水浴中保温继续培养30min后，观察，仍不变色者，则为阳性。

    (4)在实验过程中，可以做阴性和阳性对照各一份。阳性对照管以8mL无抗生素的乳，添加1mL一定浓度的抗生素(如青霉素、庆大霉素)溶液、菌液和TTC溶液；阴性对照管为9mL无抗生素乳、菌液和TTC溶液。

    3．结果报告

    综合上述测定结果，并与对照管进行比较，分析样品中抗生素是否超标。

    五、注意事项    

    1．嗜热乳酸链球菌菌种在脱脂乳培养基或在10％脱脂乳粉培养基中保存，并且不得含抗生素，每次转接间隔时间不能超过20d，否则可能会绝种。

    2．在观察结果时，应该迅速并避免长时间光照。

    3．TTC法对几种抗生素的检出限见表1。

    表1 TTC法对几种卢一内酰胺类抗生素残留的检出限

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┃    抗生素名称  ┃    最低检出量／U ┃    抗生素名称  ┃    最低检出量／u ┃

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┃    青霉素      ┃    0．004        ┃    庆大霉素    ┃    O．4          ┃

┃    链霉素      ┃    0．5          ┃    卡那霉素    ┃    3             ┃

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    六、思考题

    1．简述嗜热链球菌的分类、地位和生理特性。

    2．简述TTC法检测鲜乳中卢内酰胺类抗生素残留的不足，并提出改进措施。