一、实验目的

    掌握微生物抑制法测定牛乳及其制品中β-内酰胺类抗生素残留的原理和方法。

    二、实验原理

    微生物抑制实验(MIT)是根据抗生素对微生物生长、繁殖与代谢具有抑制作用来定性或定

量分析样品中抗生素残留的方法。

    嗜热脂肪芽孢杆菌(Bncillus stearothermophilus)具有嗜热、生长迅速、对青霉素类抗生素敏感等特性。将含有青霉素标准品及样品提取液的滤纸片分别同置于接种有该菌的同一琼脂平板表面，在特定温度下培养一定时间后，根据各纸片周围抑菌圈的情况，判定被检样品中是否含有青霉素残留。

    三、仪器与试材

    1．仪器与器材

    生化培养箱、离心机、游标卡尺等。

    2．菌种与培养基

    (1)嗜热脂肪芽孢杆菌。

    (2)菌种培养基(琼脂培养基M)：胰消化酪蛋白15.Og、番木瓜蛋白酶消化大豆5.0g、NaCl 15.Og、琼脂15.Og、蒸馏水1000mL，pH 7.3±O.2。将以上成分加热溶解，分装于500mL锥形瓶，于121℃灭菌15min。

    (3)增菌培养基、(肉汤培养基D)：胰消化酪蛋白17.Og、番木瓜蛋白酶消化大豆3.Og、NaCl 5.Og、K₂HPO₄ 15.Og、蒸馏水1000mL，pH 7.3±0.2。将以上成分加热溶解，分装于500mL锥形瓶，于121℃灭菌15min。

    (4)检测培养基(琼脂培养基B)：胰消化明胶6.Og、酵母膏3.Og、牛肉膏1.5g、葡萄糖1.Og、琼脂15.Og、蒸馏水1000mL，pH 6.5～6.6。将以上成分加热溶解，分装于500mL锥形瓶，于121℃灭菌15min。

    3．试剂与溶液

    (1)青霉素G标准液：在相对湿度≤50％的环境中称量30mg青霉素G钾盐或钠盐标准品，溶解于一定量的0.1mol／L pH=6的磷酸盐缓冲液中，以得到浓度为100～1000U／mL的标准液，避光于4℃保存，不超过48h。使用时，可根据需要适当稀释。

    (2)对照阳性滤片：吸附50μL含O.008U／mL青霉素G标准的牛乳的滤纸片(φ13mm，具有良好的吸水性能)，实验中应产生明显的抑菌圈(φ17～20mm)。

    (3)青霉素酶(β一内酰胺酶)：应有足够的酶活性，以确保在实验条件下能使样品中的青霉

素完全失活。

    4．实验材料

    1～2种鲜牛奶，各250mL；1～2种奶粉，各50g。

    四、实验步骤

    1．样品处理

    新鲜牛乳可直接使用，奶粉需用灭菌蒸馏水适度稀释。

    2．芽孢悬液的制备

    (1)先将嗜热脂肪芽孢杆菌在肉汤培养基D中于(55±2)℃增菌24～28h，再移植于琼脂培养基M的斜面上于(55±2)℃培养过夜，室温避光保存，每周转接一次，以保持菌种的活力。

    (2)从新鲜培养斜面挑取菌体，接种到盛有150mL肉汤培养基D的锥形瓶中，于(55±2)℃培养48～72h。通过芽孢染色观察芽孢形成情况，当芽孢形成率达到80％时(一般培养时间小于72h)，停止培养。

    (3)取培养液，以5000r／min离心15min，沉淀(芽孢)以无菌生理盐水反复洗涤、离心3～4次后，悬浮于30mL无菌生理盐水中，于4℃避光储存。一般可保存6～8个月，通过测定芽孢的发芽率定期检查芽孢的活力。

    3．测定平皿的制备

    (1)将芽孢悬液适当稀释后，取一定量接种于55℃琼脂培养基B中，于(55±2)℃培养3～4h。芽孢接种量以青霉素阳性对照滤纸片出现明显的抑菌圈(φ17～20mm)为宜。

    (2)将上述接种芽孢的培养基B倾人平皿(φ90mm，15mL／皿)中，水平放置，凝固后，于

4℃储藏，5d内使用有效，最好是当天倒平板当天使用。

    4．筛选实验

    (1)以无菌镊子夹持一张干燥的无菌滤纸片，使其一侧接触已充分混匀的待检奶样之表面，利用虹吸作用，以整个纸片均吸收有样品为度。如吸附过多，可将纸片轻触样品容器内壁以去除多余的液体。

    (2)迅速将滤纸片放置于已接种嗜热芽孢菌的琼脂平板上，轻轻加压使纸片能紧贴平板表面，切勿使纸片移动。一般以滤纸片距平板中心2.5cm为宜(可事先在皿底做好标记)。

    (3)以同法将阳性对照滤纸片也安放于同一平板上，标记不同滤片的位置。做三个重复。滤纸片之间相距应大于3cm。如在同一平板中安放检测样品较多时，可用同一个对照，但各滤纸片中心点与平板中心点连线形成的夹角两两之间不应小于60°，以免影响实验结果的观察。

    (4)翻转平皿，并于皿底分别做好标记后，置于(55±2)℃培养，直至阳性对照滤纸片出现

明显的抑菌圈(φ17～20mm)为止，一般为4h左右。

    (5)取出平皿观察被测样品的滤纸片周围是否有抑菌圈，并以游标卡尺测定抑菌圈直径(φ)大小。如果待测样品滤纸片的抑菌圈φ≤14mm，说明样品中不含抑菌物质，结果为阴性；若φ≥14mm，则提示抑菌物质阳性，需进行下面的实验。

    5．确证实验

    (1)将被检样品在80℃至少热处理2min后，迅速冷却至室温。按照4中(1)的方法制备待测样品滤纸片。

    (2)以无菌操作取待测样品5mL于灭菌试管中，加入0.5mL青霉素酶溶液，混匀。按照4中(1)的方法制备青霉素酶滤纸片。

    (3)按照4中(2)和(3)的操作方法和要求，分别将待测样品滤纸片、青霉素酶滤纸片、阳性对照滤纸片放置于同一个已接种嗜热脂肪芽孢杆菌的琼脂平板表面，于(55±2)℃培养3～4h至阳性对照滤片出现确定抑菌圈。

    (4)取出平皿观察抑菌圈，并测定抑菌圈的大小。如被检样品抑菌圈φ≤14mm，为阴性；若其φ≥14mm，则为阳性，提示含有抑菌物质，故应结合青霉素酶滤纸片的抑菌圈情况进一步确证该抑菌物质是否为青霉素。①如果青霉素酶滤纸片周围没有抑菌圈，则表明待检样品的抑菌圈确为青霉素所致，即卢一内酰胺类抗生素残留阳性；②如果青霉素酶滤纸片周围有抑菌圈，但其φ≤14mm，则提示样品中不仅存在着β一内酰胺类抗生素，还存在着其他抑菌物质；③如果青霉素酶滤纸片周围抑菌圈的φ≥14ram，则可确证样品中存在着β一内酰胺类抗生素以外的其他抑菌物质。

    6．结果报告

    综合上述实验结果，报告所测乳品中是否含有p内酰胺类抗生素，以及是否存在着p一内酰胺类以外的抑菌物质。

    五、注意事项

    1．在嗜热脂肪芽孢杆菌的培养中，除了可以在(55±2)℃培养外，也可以在(64±2)℃下

培养。

    2．实验所用的滤纸片一定要质地均一、大小一致、洁净、干燥，否则由于滤纸片吸收的液体体积不一致而影响实验结果。也可吸收一定量(如50uL)的液体于滤纸片上。

    六、思考题

    1．简述嗜热脂肪芽孢杆菌的分类、地位和生理特性。

    2．为什么在确证实验中被检样品应在80℃至少加热处理2min?

    3．在测定平皿的制备中，当芽孢悬液接种于55℃琼脂培养基B后，为什么需要在(55±2)℃培养3~4h?