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病毒的形态结构检查法

发布时间:2017-09-18 00:00 作者:中国标准物质网 阅读量:1986

一、形态学检查

(一)电镜技术

绝大多数病毒的大小超过了光学显微镜的分辨能力,通常只有在电镜下放大几万至几十万倍才能观察病毒的形态。

1.标本制备用电镜观察病毒颗粒必须使标本中含有大量的病毒才能进行,因此,浓缩标本是必要的。可以用超速离心或超过滤法直接浓缩标本中的病毒,也可以将标本接种于培养细胞使病毒增殖后再检查。此外,如果病毒是已知的,且有特异的抗血清,可用免疫凝集的方法浓缩病毒。常用的病毒标本制备方法有两种。①超薄切片法:也称正染法,标本用戊二醛固定,经过脱水、包埋、切片、染色后,观察病毒颗粒,本法操作复杂,但标本可长期保存。②负染法:直接将病毒悬液(也可用细胞)滴在铜网上,用重金属盐(通常用磷钨酸)进行染色,观察病毒颗粒,10~20 min可出结果,负染技术基于负性染料不渗入病毒颗粒,而是将病毒颗粒包绕,由于负性染料含重金属,不穿透电子束,使病毒颗粒具有亮度,在周围暗背景上显示亮区,这种方法较正染法显示的图像清晰,可显示病毒的表面结构,其缺点是敏感性低。

为了提高电镜技术的敏感性与特异性,在负染的基础上,又发展了免疫电镜技术。它基于抗原抗体结合形成免疫复合物的原理,用特异性抗体与样品结合,观察凝集的病毒颗粒,可使其敏感性提高10~100倍,同时病毒也较易识别。此外,还有胶体金标记技术。

2.病毒的识别负染技术将病毒分为两种形态,即裸露病毒和有包膜病毒,属于前者的有腺病毒、乳多空病毒等,属于后者的有疱疹病毒、布尼亚病毒等。大小也是鉴定病毒的标准之一,如小RNA病毒为20~40 nm,痘病毒达200~300 nm。电镜下病毒的形态有圆形、杆形、子弹形等规则形和不规则的多边形,如肠道病毒、登革病毒为圆形,狂犬病病毒为子弹形,呼肠孤病毒为六角形,疱疹病毒为圆形或多边形。有的病毒表面有刺突,如麻疹病毒、水疱性口炎病毒,而另一些病毒表面是光滑的,如单纯疱疹病毒、巨细胞病毒。RNA病毒通常在细胞浆成熟,DNA病毒在细胞核成熟(痘病毒例外)。核衣壳的对称性也是鉴定病毒特征的重要标准,DNA病毒一般为立体对称,RNA病毒一般为螺旋对称。总之,在进行病毒的形态学识别时,应充分注意其特殊性与复杂性。很多病毒,如轮状病毒、星状病毒、嵌杯状病毒、甲型肝炎病毒等,都是用电镜首先发现的。

(二)光学显微镜

光学显微镜通常很难直接看到病毒颗粒,当细胞感染某些病毒以后,在细胞浆和/或细胞核内可出现包涵体(inclusion body),通过HE染色后,在光学显微镜下可以看到包涵体。不同病毒的包涵体往往具有独特的形态、染色特性和存在部位,例如单个还是多个、圆形还是不规则形、外围有无晕圈、嗜酸性还是嗜碱性、在核内还是在胞浆内等。通过包涵体的特征往往可以推断出是哪类病毒感染。例如疱疹病毒形成核内嗜酸性包涵体,痘病毒则形成胞浆内嗜酸性包涵体,麻疹病毒同时形成核内和胞浆内嗜酸性包涵体,狂犬病病毒在患病动物的神经细胞的胞浆内形成嗜酸性内基小体等。

二、病毒大小的测定

测量病毒体大小的方法较多,如电子显微镜直接测量法、过滤法、超速离心沉淀法等,最常使用的是电子显微镜直接测量法。

1.电子显微镜直接测量法电子显微镜可直接观察到病毒的大小,将标本悬液置于载网膜上,进行负染色观察,对照电镜视野标尺,可以直接算出病毒体的实际大小。

2.过滤法将病毒液通过不同孔径大小的滤膜,根据通过与滞留病毒的孔径与滤过病毒的感染滴度可间接测定出病毒的大小。其方法如下。

(1)将病毒液(应含有少量的蛋白质,以防止病毒颗粒被滤膜或滤板吸附,一般用含2%血清或0.5%明胶或0.5%清蛋白的MEM,)10000 r/min离心20~30 min,吸取上清液进行测定。

(2)取上清液分别通过不同孔径的滤器。

(3)将未过滤的病毒液以及通过各级孔径的滤液分别用敏感细胞或实验动物测定感染力,并计算出LD50或TCID。

(4)根据通过与滞留病毒的孔径与滤过病毒的感染滴度计算出病毒的大小。

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