一、病毒分离鉴定的一般程序

病毒分离鉴定的一般程序见图33-1。

图33-1病毒分离鉴定的一般程序

二、病毒的分离鉴定

（一）标本采集

根据临床诊断及病期的不同采集不同标本（表33-1)。无菌标本（脑脊液、血液、血浆、血清等）可直接接种于细胞、鸡胚或动物；无菌组织块经培养液洗涤后制成10％～20％悬液离心后，取上清液接种；咽洗液、粪便、尿、感染组织等污染标本在接种前先用抗生素处理，杀死杂菌。

表33-1供病毒分离的检材

（二）病毒的分离培养

病毒是严格的细胞内寄生的微生物，因此，应根据病毒的种类选择敏感的动物、组织细胞或鸡胚进行病毒的分离培养。
1．细胞培养用分散的活细胞培养称为细胞培养（cell culture)。所用培养液是含血清（通常为胎牛血清）、葡萄糖、氨基酸、维生素的平衡溶液，pH7.2～7.4。细胞培养适合绝大多数病毒生长，是病毒实验室的常规技术。其细胞培养方法通常有以下几种。

(1)原代细胞培养（primary cell culture)：用胰蛋白酶将人胚（或动物）组织分散成单细胞，加一定培养液，37℃孵育1～2天后逐渐在培养瓶底部长成单层细胞，如人胚肾细胞、兔肾细胞。原代细胞均为二倍体细胞，可用于产生病毒疫苗，如兔肾细胞生产风疹疫苗，鸡成纤维细胞生产麻疹疫苗，猴肾细胞生产脊髓灰质炎疫苗。原代细胞不能持续传代培养，不便用于诊断工作。

(2）二倍体细胞培养（diploid cell culture)：原代细胞只能传2～3代细胞即退化，少数细胞在体外分裂50～100代仍能保持染色体数为二倍体，称为二倍体细胞。大多为人成纤维细胞，如人胚肺细胞。二倍体细胞一经建立，应尽早将细胞悬浮于10％二甲基亚砜中，大量分装于安瓿瓶中，储存于液氮（-196℃）内，供以后传代使用。目前多用二倍体细胞培养制备病毒疫苗，也用于病毒的实验室诊断工作。

(3）传代细胞培养（continuous cell culture)：通常是由癌细胞或二倍体细胞突变而来（如Hela, Hep-2,Vero细胞系等），染色体数为非整倍体，细胞生长迅速，可无限传代，在液氮中能长期保存，目前广泛用于病毒的实验室诊断工作，根据病毒对细胞的亲嗜性，选择敏感的细胞系使用。

2．鸡胚培养用受精孵化的活鸡胚培养病毒比用动物更加经济、简便。一般采用孵化9～14天的鸡胚，根据病毒的特性可分别接种在鸡胚绒毛尿囊膜、尿囊腔、羊膜腔、卵黄囊、脑内或静脉内（图33-2),①羊膜腔：可用于初次分离培养流感病毒。②尿囊腔：可用于流感病毒和腮腺炎病毒的分离培养。③绒毛尿囊膜：可用于接种痘病毒和疱疹病毒。④卵黄囊：可用于接种嗜神经性的狂犬病病毒和乙型脑炎病毒。如有病毒增殖，则鸡胚发生异常变化或羊水、尿囊液出现红细胞凝集现象，常用于流感病毒及腮腺炎病毒等的分离培养，但多数病毒在鸡胚中不生长。

3．动物试验动物试验是最原始的病毒分离培养方法。常用的实验动物有小鼠、大鼠、豚鼠、家兔及猴等，接种途径可根据各病毒对组织的亲嗜性而定，如鼻内、皮内、皮下、脑内、腹腔或静脉接种等，接种后逐日观察实验动物的发病情况，如有死亡，则取病变组织剪碎、研磨均匀制成悬液，继续传代，并作鉴定。

（三）病毒的鉴定

1．病毒在细胞内增殖的指征

(1)细胞病变效应（cytopathogenic effect, CPE)：病毒在细胞内增殖可引起细胞退行性病变，表现为细胞皱缩、变圆，出现空泡、死亡和脱落（图33-3)。某些病毒产生特征性CPE，倒置于光学显微镜下观察上、述细胞病变，结合临床表现可做出预测性诊断。免疫荧光法（IF）用于鉴定病毒具有快速、特异的优饭，细胞内的病毒或抗原可被荧光素标记的特异性抗体着色。在荧光显微镜下可见斑点状黄绿色荧光，根据所用抗体的特异性判断为何种病毒感染。

图33-2鸡胚接种部位示意图

图33-3病毒的细胞病变效应

(2)红细胞吸附现象（hemaclsorption phenomenon)：流感病毒和某些副黏病毒感染细胞后24～48 h，在细胞膜上可出现病毒的血凝索(bemoagglutinin,HA)，能吸附豚鼠、鸡等动物及人的红细胞，发生红细胞吸附现象。若加入相应的抗血清，可中和病毒血凝素，抑制红细胞吸附现象的发生，称为红细胞吸附抑制试验。这一现象不仅可作为这类病毒增殖的指征，还可用于病毒种和型的初步鉴定

(3）干扰现象（interference phenomenon)：一种病毒感染细胞后可以干扰另一种病毒在该细胞中的增殖，这种现象称力干扰现象。如前者为不产生CPE的病毒（如风疹病毒），但可干扰以后进入的病毒（如ECHO)病毒）增殖，使后者进入宿主细胞后不再产生CPE。

2．病毒感染性的定量测定

(1)空斑形成单位（plaque forming unit，PFli)测定：一种测定病毒感染性比较准确的方法。将适当浓度的病毒悬液接种到生长成单层细胞的平皿或培养瓶中，当病毒吸附于细胞后，再在其上覆盖一层熔化的半固体营养琼脂，待凝固后，孵育培养。当病毒在细胞内复制增殖后，每一个感染性病毒颗粒在单层细胞中产生一个局限性的感染细胞病灶，病灶逐渐扩大，若用中性红等活性染料染色，在红色的背景中显出没有着色的空斑，空斑清楚可见。由于每个空斑由单个病毒颗粒复制形成，所以病毒悬液的滴度可以用每毫升空斑形成单位（PFU）来表示。

(2) 50％组织细胞感染量(50％ tissue culture infectious dose, TCID₅₀）的测定：可估计所含感染性病毒的数量；将病毒悬液作10倍连续稀释，接种于敏感的单层细胞中，培养一定时间后，观察CPE等指标，以能感染50％的细胞最高稀释度，计算出TCID₅₀。

3．病毒形态结构的观察借助电子显微镜可直接观察分离培养的病毒颗粒，根据其大小、形态可初步判断病毒属于哪一类。

4．病毒抗原或核酸的检测 可利用已知的诊断血清或单克隆抗体来检测分离培养的病毒抗原，或用核酸杂交、PCR等方法检测病毒核酸，必要时进行核酸测序，对病毒作出进一步鉴定。