一.灭菌和消毒

培养基由于含有高浓度蔗糖，能供养很多微生物(如细菌和真菌)的生长。一旦接触培养基，这些微生物的生长速度一般都比培养组织快得多，最终将把组织全部杀死。这些污染微生物还可能排泄对植物组织有毒的代谢废物。因此，在培养容器内部保持一个完全无菌的环境是绝对必需的。为达到这个目的，有两点必须注意：①不要与微生物工作者或病理工作者共用植物组织培养工作区；②一经发现污染，立即将污染的培养物拿出培养室进行处理。

培养基的污染有几个可能的来源：①培养容器；②培养基本身；③外植体；④接种室的环境；⑤操作用的器械；⑥培养室的环境。可从以下灭菌措施防止或减少污染源。

1．培养基灭菌

装有培养基的瓶子，其瓶口要用防菌棉塞塞严，置于高压灭菌锅中灭菌。灭菌时间一般要求从由培养基达到要求温度时起消毒15～40min。所需的时间随着要进行灭菌的液体的容积而变化。如果没有高压灭菌锅，可用家用压力锅代替。当冷却被消毒的溶液时必须十分小心，如果压力急速下降，超过了温度下降的速率，就会使液体滚沸，从培养容器中溢出。注意，只有当高压灭菌锅的压力表指针回到零(温度不高于50℃)时，才能打开高压灭菌锅。

某些生长调节物质(如GA₃、玉米素、IAA, ABA)、尿素以及某些维生素等，遇热时容易分解，不能进行高压灭菌。当使用这类化合物时，可将除这种遇热分解的化合物之外的全部培养基装于一个三角瓶中进行高压灭菌，然后置于超净工作台无菌条件下冷却。热分解化合物溶液的灭菌是通过滤膜过滤进行的，然后再将其加入高压灭菌过的培养基中。如果是要制备固态培养基，需待培养基冷却到大约40℃时(即恰在琼脂凝固之前)再加入这种无菌的热分解化合物；如果是要制备液体培养基，则要待培养基冷却到室温后再加。在进行溶液过滤消毒时，可使用孔径为0.45um或更小的细菌滤膜。将滤膜安放在适当大小的支座上，以铝箔包裹起来，或装入一个大小合适的有螺丝盖的玻璃瓶内，进行高压灭菌。过滤器的灭菌温度非常重要，不应超过121℃。把一个装有需要灭菌溶液的带刻度注射器(不必灭菌)安装到已灭过菌的过滤器组件的一端，缓慢地推动溶液使之穿越安装在这个过滤器组件中间的细菌滤膜，过滤后的溶液由过滤器组件的另一端滴下来，直接加入培养基中，或收集到一个灭过菌的玻璃瓶内，然后再用一个灭过菌的刻度移液管移到培养基中。如果要对大量溶液进行过滤灭菌，可用较大的过滤组件。不过，在进行上述操作之前，首先应澄清要进行过滤灭菌的溶液，方法是使之通过一个三号孔隙度的烧结玻璃过滤器，或先用一个0.65um的滤膜进行初滤，这样可以减少0.45um滤膜过滤器微孔的堵塞，从而使过滤灭菌比较通畅。

2．器皿和用具灭菌

玻璃培养容器常常与培养基一起灭菌。若培养基已先灭菌，只需单独进行容器灭菌时，可采用高压蒸汽灭菌法，也可将它们置于烘箱中在160～180℃下干热处理3h。干热灭菌的缺点是热空气循环不良和穿透很慢。因此不应把玻璃容器在烘箱内放得太挤。灭菌后需待烘箱冷却下来后再取出玻璃容器。如果尚未足够冷却即急于取出，外部的冷空气就会被吸入烘箱，有可能导致里面的玻璃器皿受到微生物污染，甚至有发生炸裂的危险。

有些类型的塑料器皿也可进行高温灭菌。聚丙烯、聚甲基戊烯、同质异晶聚合物等可在121℃下反复进行高压蒸汽灭菌。聚碳酸盐(polycarbonate)经反复高压蒸汽灭菌后机械强度会有所下降，因此每次灭菌的时间不应超过20min。

对于无菌操作所用的各种器械，如镊子、解剖刀、解剖针和扁头小铲等，一般的消毒办法是把它们先在95％乙醇中浸一下，然后再在火焰上灼烧，待冷却后使用。这些器械不但在每次操作开始前要这样消毒，在操作期间还要再消毒几次。

3．外植体消毒

植株各部分的表面携带着各种污染微生物。为了消灭这种污染源，在把植物组织按种到培养基上之前必须进行彻底的表面消毒；内部已受到真菌或细菌侵染的组织应淘汰。

植物组织采用杀菌剂浸泡的方法进行消毒，常用的外植体消毒剂有近10种，其中次氯酸钠或次氯酸钙溶液使用较普遍，见表1-3。例如，用0.3％～0.6％次氯酸钠溶液处理可使大多数组织得到消毒。不过必须注意，表面消毒剂对植物组织也是有害的。因此，应当正确选择消毒剂的浓度和处理时间，以尽量减少组织的死亡。

表1-3 一些表面消毒剂及使用方法

对某些植物组织也可用乙醇或异丙醇进行表面消毒(不要使用甲醇)，把材料浸泡数秒钟后，放在超净工作台上使乙醇或异丙醇蒸发掉。

较大、较坚硬的外植体容易操作，可直接用灭菌剂进行处理。例如，大戟属植物成熟种子或成熟胚乳的消毒可对整个种子进行处理。然而，如果要培养未成熟胚珠、胚或胚乳，习惯的做法是分别把子房或胚珠进行表面消毒，然后在无菌条件下把外植体解剖出来，这样做就可以使柔软的接种组织不致受到杀菌剂的毒害。同样，若要培养柔嫩的茎尖或花粉粒，需分别把茎芽或花药进行表面消毒，然后在无菌条件下取出外植体。在用杀菌剂处理之前先把植物材料在70％乙醇中浸30s，或在消毒溶液里加几滴表面活化剂，如Triton-X或Tween-80，会提高杀菌效果。在进行茎尖培养时，只要在解剖时十分小心，即使不对茎芽进行表面消毒处理，也能得到频率很高又不受污染的培养物。在表面消毒处理之后，必须在无菌水中把材料漂洗3次或4次，以除掉所有残留的杀菌剂，但若是用乙醇消毒，则不必漂洗。

如果外植体表面污染很严重或有泥土，对其需先用流水冲洗1h或更长的时间，或者先通过种子培养得到无菌种苗，然后再用其无菌组织或器官作外植体。

4．接种区灭菌

无论是接种还是继代，当培养容器敞着口的时候，必须防止任何污染物进入容器，为此所有的操作都必须在严格的无菌条件下进行。近年来多数实验室都使用各种类型的超净工作台进行无菌操作。但接种区灭菌仍非常重要。

在开始实验前要制定好实验计划和操作程序，有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品，清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。这样可以避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。

接种室和培养室每天都要用0.2％的新洁而灭或2％～5％来苏儿拖洗地面一次(拖布要专用)，紫外线照射消毒30～50min，超净工作台台面每次实验前要用70％乙醇擦洗，然后紫外线照射消毒30min。在工作台面消毒时切勿将培养组织和培养用液同时照射紫外线，消毒工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线，降低消毒效果。一些操作用具，如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用70％乙醇擦洗后置于工作台内同时紫外线照射消毒。

二.无菌操作技术

由于体外培养细胞没有抗感染能力，因而防止污染是决定培养成功与否的首要条件。即便使用设备完善的实验室，若实验者粗心大意，技术操作不规范，也会导致污染。因而，为在一切操作中尽最大可能地保证无菌，每一项工作都必须做到有条不紊和完全可靠。

进入接种室需彻底洗手并按外科手术要求着装，帽子和口罩每次实验后都要清洗消毒。开始操作前要用70％乙醇消毒手和前臂。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。平时仅做观察不做培养操作时，可穿经紫外线照射30min的一般清洁工作服。培养室外最好准备好几套这样的工作服，便于随时进入培养室穿用。

为保证做到无菌操作，除实验中所用物品需事先消毒外，在实验中还要保持无菌操作。因此在进行实验前，要点燃酒精灯，一切操作，如安装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都应在火焰近处并经过烧灼进行。但要注意，金属器械不能在火焰中长时间烧灼，以防退火。烧灼过的器械要冷却后才能使用，如镊子应冷却后才能夹取组织，否则可能造成组织细胞损伤，已吸过培养液的吸管不能再用火焰烧灼，因残留在吸管内的培养液(如蛋白质)等烧焦后会产生有害物质，吸管再用时会将其带到培养基中。开启、关闭长有培养物的培养瓶时，火焰灭菌时间要短，防止因温度过高烧死培养物。另外，胶塞、橡皮头过火焰时也不能时间过长，以免烧焦产生有毒气体。

工作台面上的用品要放置有序、布局合理。酒精灯在中间，右手使用的物品在右侧，左手用品在左侧。工作忌忙乱而要有顺序；组织、细胞及培养板在未做处理和使用前，不要过早暴露于空气中，应分别使用不同吸管吸取营养液、细胞悬液及其他各种用液，不能混用。用吸管、注射器进行转移液体操作时，吸管、注射器针头不能触及瓶口以防止细菌污染或细胞的交叉污染。

三、植物组织无菌培养的一般步骤

(1)将植物组织块置于一个有螺丝盖的玻璃瓶中，注入含有几滴活化剂的浓度适当的消毒液，使材料完全浸没在消毒液中，盖上盖，把玻璃瓶置入超净工作台。消毒期间需把玻璃瓶摇动2次或3次，使消毒液充分接触植物组织。

(2)消毒处理后，将瓶盖打开，将消毒液倒出，注入适量的无菌蒸馏水，再盖上盖，摇动数次，将水倒掉，如此重复3次或4次。

(3)将材料取出，置于一个已经灭菌的培养皿中。

(4）在对植物材料进行消毒处理的同时，对所要使用的器械进行消毒，方法是将它们置入95％乙醇中，取出后再置酒精灯火焰上灼烧，待冷却后即可使用。所有操作器械需要使用一次，消毒一次。

(5)用这些消过毒的器械（如解剖刀、解剖针、打孔器、剪刀、解剖镜等）将已经过表面消毒的材料切取或剥取适当的外植体。

(6)将培养容器的盖或塞子打开，将外植体接种到培养基上，如果使用的是玻璃培养容器，把瓶口置酒精灯火焰上烘烤数秒钟，然后迅速用瓶盖或瓶塞封严。