一、愈伤组织的诱导

愈伤组织最初是指植物受到机械损伤时，在愈合伤口处长出的一团瘤状突起，该瘤状突起内的细胞相对于植物体内成熟体细胞已发生了脱分化的变化。这种创伤愈伤组织的概念后来被引入植物组织培养领域。愈伤组织现多指将植物体的某个部分切下，用做外植体，接种到适宜的培养基上培养，外植体组织增生而产生的一团脱分化的细胞组织。

植物外植体，如根、茎、叶、果实、子房、花粉、花瓣等各种器官或组织，当将其与母体分离并培养在含有适宜浓度植物激素的培养基上时，它们就可能转变为一种能迅速增殖的细胞团，即愈伤组织。然而，最近的研究发现，愈伤组织实际上也是一个有结构的、分化的组织，愈伤组织主要来源于一类特化的成熟干细胞群，并非所有的植物细胞。

可以说，所有的多细胞植物均具有诱导产生愈伤组织的潜在可能性。理论上讲，诱导愈伤组织成败的关键不在于植物材料的来源，而在于培养条件。其中，激素的成分和浓度是极为重要的因素。生长调节物质，特别是生长素，对于细胞分裂的诱导以及其后的生长和增殖都是必要的物质。细胞分裂素未必是必需的物质，然而，常常因不同的供试材料而异。例如，大豆根部，在只含生长素的培养基中，分裂细胞主要来自中柱鞘，相反，如果加入激动素，则皮层细胞也会被诱导而分裂。因此，即使是同一个器官，也会因不同组织而对激素的要求有所不同。

根据诱导植物细胞愈伤组织的研究目的和用途不同，可以选用不同的器官作为外植体进行离体培养，以建立无性系培养物，作为研究和快速无性繁殖的材料。

(一)愈伤组织的诱导

从单个细胞或外植体上脱分化形成典型的愈伤组织，大致经历三个时期：启动期、分裂期和形成期(Petru,1974)。

1．启动期

启动期(initiation stage)又称为诱导期(induction stage)，是愈伤组织形成的起点。外植体已分化的活细胞在外源激素的作用下，通过脱分化启动而进入分裂状态，并开始形成愈伤组织。这时在外观上虽然未见明显变化，但实际上细胞内一些大分子代谢动态已发生了明显改变，细胞正积极为下一步分裂进行准备。细胞的合成代谢活动加强，迅速进行蛋白质和核酸等物质的合成。形成愈伤组织时，RNA及蛋白质的变化明显。一些研究发现，绿豆子叶形成愈伤组织的初期RNA含量明显增加，枸杞叶片接种后的12h过氧化物酶的活性就开始上升，到24h其酶活性又升高1倍。

通常情况下，接种的外植体细胞是处于静止状态的成熟细胞，一般不进行分裂。但静止细胞并未丧失其在分生组织状态时的那种分裂潜能，只是在分化过程中产生了一类抑制物抑制了其分裂的能力。如果去除这类抑制物质，就能使分化的体细胞恢复分裂活力。研究发现，这些抑制物质的作用是阻碍DNA复制，若加入消除抑制影响的物质，那么细胞就会立即进行复制，进入细胞分裂周期的S期，并发生同步分裂。然而，诱导植物细胞分裂，实际上要受很多环境因素的影响。机械损伤就是引起诱导组织细胞分裂的一种刺激因素。最新研究结果表明，伤口处AP2/SRF类转录因子WIND1迅速激活，上调细胞分裂素的响应，从而促进细胞去分化和增殖，最终形成多细胞团，也就是愈伤组织(Iwase etal，2011)。外源激素是一种能诱导细胞开始分裂的诱导剂，通常可以通过调整外源激素的种类和浓度来诱导细胞开始分裂。2,4-D处理静止状态的组织时，细胞的RNA含量明显增加，而且2,4-D可积累在分裂细胞的核仁中。在小麦成熟胚脱分化培养过程中，有80个生长素相关基因的表达发生了变化，这些基因涉及生长素的运输、响应、诱导、合成和降解等多个生物学过程(Chen etal，2009)，进而调控细胞基因的表达。分子和细胞证据显示，拟南芥中愈伤组织的形成并不是一个简单回复到未分化状态的过程(Sugimoto etal，2010)。

离体培养的成熟细胞在分裂前内部会发生一系列的变化。Yeoman和Evans (1967)在应用放射性自显影的方法观察菊芋的体外培养过程中发现，在培养开始后10～12h，首先DNA合成变得活跃，此后8h，约有40％细胞已经吸收了3H-胸腺核苷。RNA和蛋白质含量显著增加，这在活跃进行DNA合成的细胞中才可见到，而未参与分裂的细胞所发生的变化不显著。开始培养后20h左右，细胞核分裂指数增加，并且达到高峰，隔数小时后，可以看到细胞数急剧升高。

愈伤组织形成时，一般可以看到呼吸加剧及酶活力增强。呼吸系统的酶活性在最初呼吸强度升高期间几乎没有变化，经过24～48h后，其活性就表现出显著加强。这是因为在培养后较短的时间内，呼吸加速取决于组织细胞已经具备的酶，而且在不添加生长素(2,4-D)的培养基中也可看到酶活性同样提高。其后酶活性的增加，是在培养基中生长素的参与下诱导形成的。

2．分裂期

分裂期(division stage)是外植体切口边缘开始膨大，外层细胞通过一分为二的方式进行分裂，从而形成一团具有分生组织状态细胞的过程。外植体细胞一旦经过诱导，其外层细胞便开始细胞分裂，使细胞脱分化。这时组织细胞代谢十分活跃，发生了一系列生理生化及形态的变化。培养组织的细胞中RNA及其一些成分随着细胞的不断分裂而开始减少，最后细胞内这些成分的积累又和分裂达到一种协调状态，细胞的体积不再减小，内无大液泡，细胞核大，核仁明显。在这个继续分裂、RNA减少的过程中，DNA含量始终保持不变。由于细胞分裂的速率大大超过了细胞的生长速率，结果使每个细胞体积显著减小、鲜重下降，但细胞的数目迅速增加。例如，胡萝卜组织经过7d的培养后，细胞数可增加10倍。这些变化表明，原来已分化的细胞已经回复变化为具有分生状态的脱分化的细胞，这些大量分生状态的细胞团形成了愈伤组织。

3．形成期

形成期(formation stage)是指外植体的细胞经过诱导、分裂形成了具有无序结构的愈伤组织时期。这个时期的特征是细胞大小不再发生变化，愈伤组织表层的分裂逐渐减慢和停止，接着内部组织细胞开始分裂，细胞数目进一步增加。细胞分裂以平周分裂为主，从而使创伤形成层的细胞呈辐射状排列。在组织表面细胞分裂减缓和内部较深处细胞开始分裂的同时，分裂面的方向发生了改变，大量分裂的细胞冲出表层细胞，出现了类似于维管束或顶端分生组织的瘤状结构外表，从而使活跃生长的愈伤组织形成一种“泡状”增殖状态。

在愈伤组织的形成过程中，尽管在形态上可以划分出启动、分裂和形成三个时期，但实际这些时期的界限并不是十分严格的，尤其是分裂期和形成期，它们往往可以在同一组织块上观察到。所以，根据组织和细胞的形态、结构、大小以及一系列生理生化代谢水平划分三个时期，只是便于更好地了解愈伤组织生长时的相对状况。

(二)愈伤组织的形态

根据外植体来源不同，愈伤组织可以发生自形成层、皮层、髓、次生韧皮部及木质部薄壁组织和表皮等。来自不同植物外植体的愈伤组织，其质地和物理性状差异很大。有的很紧密坚实，有的很疏松脆弱或呈胶质状；有的呈淡黄色，有的呈白色或淡绿色等。愈伤组织在长期的培养中能够形成分生组织区、管胞和色素细胞，或者形成体细胞胚。这种能够形成体细胞胚的愈伤组织称为胚性愈伤组织(embryonic cal-lus)。在野生稻组织培养实验中，发现从短花药野生稻的幼穗和茎节均能诱导出质地致密的呈淡黄色的胚性愈伤组织(图3-1)。宽叶野生稻的幼穗愈伤组织呈疏松的白色。在禾本科植物组织培养中，经常可以见到形成紧密的、不透明的、白色到淡黄色的胚性愈伤组织，这种愈伤组织表面光滑光亮、呈球状，不久由球状变为杯状结构。常常需要把培养基中的胚性愈伤组织分离出来进行单独继代培养。

图3-1短花药野生稻茎节诱导的胚性愈伤组织(谭光轩，1997)

在离体培养的中华猕猴桃茎段中所产生的愈伤组织通常为致密的瘤状，并呈淡绿色或绿色，生长缓慢。在2,4-D的作用下，愈伤组织则变为黄白色，脆弱易于分散。但若诱导条件不同，愈伤组织的形态和物理性质也有一定的变化。在柑橘子叶培养中，在MS附加lmg/LNAA和0.2mg/L 6-BA培养基上形成的愈伤组织紧密坚实呈瘤状，而在MS附加0.2mg/L 2,4-D和0.2mg/L 6-BA培养基上形成的愈伤组织则疏松易脆。质地不同的愈伤组织，有时可以相互转变，有时则是不可逆的。这种互变可以发生在愈伤组织生长的过程中，可能和消耗了培养基中的养料有关；也可以通过改变激素浓度的方法来诱导。培养基中加入高浓度的生长物质，可使坚实的愈伤组织变为松脆；反之，减少或除去生长物质，则松脆愈伤组织可转变为坚实的愈伤组织。

然而，具有相似的细胞团块的愈伤组织也常常包含着形态和机能各不相同的细胞群。在固体培养时，通常处于最表层部位的细胞与处于最下层而靠近培养基的细胞，其生长环境有着明显差异，而且其代谢活动和生长形式也不同。在不与琼脂培养基接触的表面，细胞的蛋白质合成能力较强，富含细胞质，膜系统发达，其外缘区迅速增殖形成近表面瘤状物的生长。而与培养基接触的一面细胞极少发生增生，细胞中蛋白质的合成能力较弱，液泡巨大，生长缓慢，仅仅是细胞分化形成紧密的组织块。

二、继代培养

随着培养时间的延长，愈伤组织的细胞在增殖过程中会不断消耗其培养基中的营养物质。同时，培养基中的水分会逐步散失，组织细胞生长过程中次生代谢物质则不断积累，这些情况必将严重影响培养中愈伤组织的继续生长。因此，愈伤组织培养一段时间后必须转移到新鲜培养基上以保持培养物的正常生长，更换一次培养基称为一次继代培养(subcul-ture)。第一次继代培养的时间取决于愈伤组织的生长速度。一般情况下，初代愈伤组织生长到直径2～3cm时可将其与外植体分离，并将其打散或切成小块转移到新鲜培养基上继代培养。如果愈伤组织的大小或形状不规则，则可选取生长迅速的部位作为继代培养的初始材料。通常情况下，生长迅速的愈伤组织外表多呈浅色、质地松散、易分散。

一般情况下，培养中的愈伤组织需要每4～6周继代一次。如果长时间不进行继代培养，因代谢产物的积累而产生毒害作用，就会使愈伤组织变成黑褐色，称为褐化(browning)如有褐化发生，继代培养时应切除褐色的愈伤组织。有些褐色的愈伤组织经多次继代培养也能恢复活力而正常生长。因此，通过继代培养维持愈伤组织生长，是一种长期保存愈伤组织的方法。如果将愈伤组织转移到液体营养基中，可以通过不断摇动液体培养基进行悬浮培养(suspension culture)。这个过程也同样需要反复地继代培养，以建立悬浮培养细胞系。这种方法可用于单细胞繁殖、原生质体分离及其再生植株的研究。

三、悬浮培养及其用途

悬浮培养是将游离的植物细胞或小的细胞团置于液体培养基中进行培养和生长的一种技术。细胞悬浮培养是在愈伤组织液体培养的基础上发展起来的一种新的培养技术。一般是将一些生长旺盛的小块愈伤组织放入液体培养基中，进行振荡培养，从而使愈伤组织块变成具有良好分散性的细胞和小的细胞聚集体。与固体培养比较：首先，悬浮培养可以增加培养细胞与培养液的接触面，改善营养供应；其次，在振荡条件下可避免有害代谢产物的局部积累而对细胞自身产生毒害；振荡培养还可以适当改善气体的交换。愈伤组织通过悬浮培养能产生大量的比较均一的细胞，而且细胞增殖速度快，适宜进行大规模细胞的培养。因此，这一细胞培养技术不仅为研究细胞的生长和分化提供了一个独特的实验系统，也为植物细胞突变体筛选进行抗性育种创造了基本技术条件。同时，植物细胞培养也可用于次生代谢物质的生产，特别是在植物产品工业化生产上具有巨大的应用潜力。

(一)悬浮培养的发动

悬浮培养通常是将已建立的愈伤组织转移到液体培养基中开始的。在悬浮培养过程中，液体培养基要进行搅拌或振荡使培养细胞悬浮于培养基中。与固体表面培养相比，液体培养的各个细胞均处于比较一致的生活环境中。然而，悬浮培养物并不是完全由单个细胞组成的，其多半是游离的单个细胞与大大小小的细胞团块相混合。构成这种团块的细胞与游离的细胞在生长速度及其他性质上存在差异时，其整体的生长方式就显得非常复杂。理想的悬浮培养要求其组成的细胞在形态和生理生化上都应一致。而培养细胞之间在形态上的不均一性和由聚集程度不同造成的细胞生理生化特性的差异是显而易见的。另外，一个不可避免的情况是：在长期的体外培养条件下，除了产生细胞大小、形态和代谢的不均一外，不同细胞也会出现遗传上的不一致性。

因此，选择易于分散的细胞类型，以及在培养过程中创造利于分散的条件都是很重要的。许多因素都会影响到愈伤组织的脆性，以及它在液体培养基中的分散程度。①一般选用很疏松的愈伤组织材料进行悬浮培养，因为这些愈伤组织能最大限度地分散开并产生悬浮培养物。例如，有人把菜豆、豌豆、大豆和甘薯的愈伤组织块转移到液体培养基中，得到初始的悬浮培养材料后，每隔7d处理一次并保留容器上部含悬浮细胞的液体，经过40d连续培养后，培养液中只有游离细胞和很小的细胞团块，形成新细胞的速率也比最初的悬浮培养液显著提高。因此，优先选择游离细胞和小的细胞集聚块进行再培养可以显著提高细胞的分散度。②培养基组成影响细胞的分散程度。适合于双子叶植物(如蔷薇和番茄)的培养基，并不一定适合于单子叶植物(如玉米)和裸子植物(如银杏)的培养；对于不容易分散开的组织，可以通过调整培养基成分来改进。疣粒野生稻(Oryza meyeriana)悬浮培养细胞的生长在AA2培养基中比在N。中好得多(He etal.,1998)。培养基中植物激素及其浓度也常常会明显地影响细胞的分散度。生长素较多则分散得好，较少则差。

(二)继代培养

随着培养时间的延长，常常要更换新的培养液以满足细胞生长的需要。根据在培养过程中是否更换新鲜培养液，将悬浮细胞继代培养分为成批培养和连续培养。

1．成批培养

在植物细胞培养中，进行细胞生长和细胞分裂的生理生化研究工作时，常常应用成批培养(batch culture)的方法。成批培养是指在除了气体和挥发性代谢产物可以同外界空气交换以外的密闭容器中，进行分散细胞的培养。离散的细胞生长在一个含有固定体积的液体培养基中。液体培养基需要进行适当搅拌或振荡以维持游离细胞和细胞团的均匀分布，并促进它们与大气进行气体交换。在一个含有固定体积的液体培养体系中，一定时间内培养细胞的数量将迅速增加，并达到一个最大产量程度。此时，液体培养基营养的消耗或某些其他因子(如有毒物质)的积累会使细胞的增殖生长停止，只有通过更换新的液体培养基才能维持培养细胞的持续增殖生长。成批继代培养的方法是使用吸量管或移液器吸取一定量的含有悬浮细胞的液体，然后转接到含有新鲜液体培养基的容器中进行下一批的悬浮细胞培养。

在成批培养的整个过程中，随着培养时间的不同，细胞数目会不断发生变化，呈现出一定的细胞生长周期。培养细胞的生长周期是指从细胞悬浮培养开始，到细胞分裂增长停止为止。在整个生长周期中，细胞数目的增加情况大致呈S形曲线。初期是细胞数增长缓慢的时期，称为延迟期(lag phase)，此期间是代谢变化最激烈的时期。已经知道在细胞数量增加之前，蛋白质和DNA的合成旺盛，其含量在细胞内显著提高。中期为生长最快时期，称为指数生长期(exponential growth phase)，这是一个相对持续时间较短的时期，但是总的细胞数、细胞干重和细胞蛋白质都是以一定的速率增长着，以细胞数增长最快。随着细胞数目的增加和代谢物质的积累，培养基中营养物质逐渐消耗尽。最后细胞的增殖生长趋于停止时就进入了成批培养的后期，即静止期(stationary phase)。进入静止期后，细胞数目不再增加，细胞的生物产量也不再上升；细胞中小液泡彼此汇合成大液泡，占据着细胞的绝大部分容积；这时的细胞利用细胞内的储存物或利用自溶细胞中释放出的代谢产物，进行非常弱的细胞代谢活动，并仍可在此培养液中存活一段时间。若要重新恢复细胞的增殖生长，则必须更换新鲜液体培养基进行继代培养。

2．连续培养

连续培养(serial culture)是指在培养过程中，以不断抽取悬浮培养物并注入等量新鲜培养基，使培养物在培养液中不断得到营养物质补充和保持其恒定体积的培养。这种培养具有与成批培养不同的特点。连续培养的营养物质得到不断更换，保证了养分的充分供应，从而使悬浮培养物不会发生营养不足的现象；这种悬浮培养物产生新细胞的速率正好补偿了被排出的细胞，从而使细胞长久地保持在对数生长期中；在此情况下，细胞的密度、生长速度、化学成分和细胞的代谢活性都维持恒定，因此，可以产生一个稳定的培养状态；还可以把培养基流动与培养特点(如光密度及培养基pH等)的改变直接联系起来建立稳定系统，用于大规模工业化生产。