在植物体细胞愈伤组织培养中，细胞的分裂常常以无规则的方式发生并产生无明显形态或极性的无结构组织团。然而，若将它转入分化培养基中，愈伤组织可以再生分化完成形态发生(morphogenesis)而产生芽根结构的分生组织或胚状体。继之，由这些有结构的组织发育成完整的小植株。植物组织细胞离体培养中的形态发生可通过器官发生(organogene-sis)和体细胞胚胎发生(somatic embryogenesis)这两种途径形成再生植株。这种形态发生途径都是以细胞分化为基础的，它包括组织和器官的形成。这一现象说明，通过组织培养的研究也可以阐明植物细胞的全能性及形态变化的可塑性。这种经脱分化以后再形成器官原基的情况，对了解组织分化和器官形成有着十分重要的意义。

一、器官发生与植株再生

植物组织和细胞培养中分化出的不同组织能形成各种器官，如根、茎、叶和芽等。根据起源不同可将器官分化分为两种发生方式，一种方式是器官由切下的外植体中已存在的器官原基发育而成；另一种方式是从外植体脱分化中形成愈伤组织，再在新形成的愈伤组织或经继代培养的愈伤组织上产生一些分生细胞团，随后由这些分生的细胞团分化成不同的器官原基。通常器官原基的发生起始于一个细胞或一小团分化的细胞，经分裂后由它们产生类分生组织细胞团。在形态上一团类分生组织细胞具稠密的原生质和显著增大的核。类分生组织的进一步活动使构成的器官在纵轴上出现单向极性及表现出器官的分化。然而，在组织培养中出现类分生组织的细胞团也并不是总与器官形成有关，在很多情况下，它们也可继续形成为愈伤组织或只分化成维管组织结节。

在组织培养中最常见的分化器官是芽和根。根据对组织培养中芽和根器官形成的大量观察表明，两者可在同一培养物上形成。一般情况下，分化产生芽的部位其基部很易形成根，而在愈伤组织上如先分化形成根，则往往抑制芽的分化形成。因此在组织培养中最好先诱导分化出芽。愈伤组织培养中常见的器官发生方式是通过愈伤组织培养物诱导形成不定芽，进而再生成植株。但在胡萝卜细胞悬浮培养和油菜愈伤组织的分化过程中，也观察到先形成根，然后再形成芽的情况。

在多种植物短枝扦插中极易形成不定根。在组织培养中，最常见的再生器官类型也是根的形成。自从1939年Nobecourt在胡萝卜培养中首先观察到根的形成，以后在大量的植物培养中均报道有根的形成。例如，水稻、玉米、油菜、棉花、烟草和蜀葵等植物的愈伤组织，在一定的条件下很易诱导分化形成根。同一种植物不同器官的离体培养中，报道成功诱导形成根的例子也很多。例如，由烟草的茎髓组织、叶肉组织和叶脉，棉花幼苗的子叶和下胚轴，油菜的叶片、叶柄和下胚轴等，在很多情况下均可产生根。

一般情况下，通过愈伤组织分化形成芽和根而再生植株的方式可分为三种类型。第一种类型是在愈伤组织上先产生芽，待芽伸长后，在其茎基部直接生根而形成完整小植株，这是组织培养中较为普遍的一种植株再生方式。在这种类型的分化培养中，人们常常把诱导出芽与诱导生根分两步进行。首先把培养基上的愈伤组织诱导产生芽，待芽长成一定大小的苗后，再把小苗转入到含NAA或IBA的生长素培养基上生根。第二种类型是在愈伤组织上先分化出根，再从根基部分化出芽而形成小植株，双子叶植物中这种形式较为普遍，而单子叶植物中相对较少。第三种类型是在愈伤组织的不同部位分别形成芽和根，然后二者结合起来形成一株完整的小植株，而且只有芽和根的维管束是相通的，才能得到成活的植株。这种方式发生在多种植物组织培养中，它们的芽和根的分化可以是同时的，也可以略有先后。芽和根分化后一般是随着愈伤组织中已存在的管状分子继续分化维管组织。芽中的维管组织向下分化，并推测芽与根的两种维管组织由此相互连接，成为统一的轴状结构而形成再生植株。

大量的组织学观察表明，在短期培养中，新形成的分生组织，即器官原基的位置常常与原来所在外植体的组织保持一定联系。芽原基多起源于培养物的组织表层细胞，是外起源的。例如，烟草茎切段的芽原基大多由接近表面的外韧皮部产生；菊苣的芽原基来自形成层的细胞；一品红幼苗下胚轴上形成的芽起源于皮层；白皮松子叶上的不定芽是由表皮部分细胞发育而来的；旋花的根切段在靠近原生木质部的细胞中发育出茎叶或芽。对于培养时间较长而且经愈伤组织阶段再分化出芽的类型，在大多数情况下器官原基是从培养物的薄壁组织细胞部分产生的。在罗汉松和葡萄按离体茎培养中，从皮层启动发生的愈伤组织表面再经片状分生细胞团形成分生组织，可进一步分化出叶原基形成芽。在这种情况下，芽的起源和发生与分生组织结节或维管结节没有联系。但也有芽的再生与维管结节有关联的情况。在红杉的愈伤组织表面有苗端分生组织发生时，可看到其内方有一维管组织结节，而且它的形成层细胞向外延伸与苗端分生组织相连。

至于根的分化形成情况则较为一致。根原基发生于组织的深处，即与整体植株一样是内起源的。不论是在木本植物油橄榄或红杉的组织培养中，还是在禾本科植物水稻的培养物中，人们都观察到了根原基的发生与维管组织结节有联系的现象。在形成器官原基之前，芽和根发生在培养物的早期脱分化阶段可能是相同，但也有人认为它们在原基发生时可能没有区别。1965年Toorey曾提出，组织培养中的器官或有组织结构的细胞团的形成均起源于一团未分化的细胞或分生细胞团，这一结构能够对分化形成器官的刺激作出相应的反应。根据刺激的性质和方向的不同，可以使它们分化形成芽、根或胚状体。按照这一观点，早期的根和芽原基应该是没有区别的，器官分化的类型可能是稍晚的时候才决定的。

二、体细胞胚胎发生与植株再生

在正常情况下，植物发育到一定阶段，精子与卵结合形成合子，合子进一步发育成胚(embryo)，胚再经发育成为成熟的植株。这是一种由性细胞结合形成的胚。在组织培养中，由离体培养的植物组织细胞也能分化出胚。由离体的组织和细胞首先进行脱分化，之后再分化，或者向器官发生途径方向发展，形成单极的芽或根；或者向具有两极的胚状体(em-bryoid)方向发展。由于培养的植物组织细胞一般是体细胞，因而将由离体培养的组织细胞分化出的胚称为体细胞胚(somatic embryo)；又由于离体培养的植物组织细胞是在未经过有性过程的情况下直接产生胚这一结构的，并且形成的胚与性细胞形成的胚相似，因此也将此胚称为胚状体。在离体组织细胞培养形成胚状体的过程中，体细胞分裂增殖并顺序通过原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷形胚期和子叶期5个时期，进而形成完整的植株(图3-2)。这与整体植物中受精卵的发育过程极为相似。但在具体的培养过程中，体细胞胚的发育进程在不同植物中有一定的差异。

图3-2胡萝卜体细胞胚胎发生(Zimrnerman,1993)

在短花药野生稻组织细胞学观察中发现，当胚性愈伤组织转为分化培养时，愈伤组织首先增殖形成淡黄色干燥而紧密的结构，其表面的细胞小而排列紧密，随后出现许多球形胚(图3-3A)。光照条件下继续培养时，胚性愈伤组织逐渐出现绿色或白色区域，20d后出现绿芽点或白芽点。切片观察表明，在未分化之前这些类原形成层的分生组织细胞随机排列，细胞进行平周分裂，形成辐射区域(图3-3B)。靠近中间的细胞虽小而排列紧密，但内含物少、染色淡，分裂已不旺盛，除了一些类原形成层区域外，大多数细胞趋于老化。辐射组织的出现表明细胞由内向外生长呈极性，是形态发生的标志。在平周分裂(periclinal division)过程中，分生组织中细胞由于生长活性不同，形成周缘的不整齐，进而形成多个瘤状突起，因而胚性愈伤组织外观凹凸不平。

图3-3短花药野生稻的胚性愈伤组织分化及其再生植株(谭光轩等，2002)

在胚性愈伤组织顶部，未与培养基接触的胚性愈伤组织分化形成干燥区域。这一区域的胚性愈伤组织颜色明显有别于其相邻组织，常出现在胚性愈伤组织的顶部，形成一些瘤状突起。组织切片可以见到，干燥区域内组织致密，细胞排列紧凑，细胞小而胞质浓，染色较深，内部有一着色深的原形成层束的结构(图3-3C)。干燥区域组织进一步分化时，即引起器官发生，形成簇生的白色叶状物，表面疏松，呈珊瑚状，有时部分细胞含叶绿素，呈绿白相间的簇生结构。

一些胚性愈伤组织表层分化组织呈极性生长，产生突起，形成许多瘤节，此即为子叶型胚(图3-3D)。体细胞胚胎进一步发育生长，即分化产生根芽结构(图3-3E)，最终发育成完整的小植株(图3-3F)。

胚状体作为植物离体生长的基本方式之一，既可由愈伤组织间接形成，也可由外植体的细胞直接形成。直接形成胚(directly embryoid formation)是指在外植体某些部位直接分化出胚状体，如山茶子叶培养后，直接从子叶基部的表皮细胞产生体细胞胚；间接形成胚(indirectly embryoid formation)是指在外植体上先分化出胚性愈伤组织，然后由胚性愈伤组织再分化形成胚状体。Sharp等(1980)认为，直接体细胞胚胎发生和间接体细胞胚胎发生途径的主要区别在于进行胚胎的起始方式不同。经直接发生形成的体细胞胚来自一些尚未完全分化的幼小分生细胞。这些细胞发育的可塑性较大，能对外界环境的诱导产生反应，继而引起发育途径的逆转。有人称以这种方式起始的细胞为前胚性决定细胞(pre-embryogen-ically determined cell)。这种细胞的胚胎发生潜力是已经决定了的，外界的生长调节因子和适当的条件仅仅是促进细胞进入胚胎发生的轨道而已。间接胚胎发生的方式起始较复杂。Maheswaran等(1985)认为它要经历分化细胞的脱分化，愈伤组织的增生和胚胎发生的重新决定。这种方式的起始细胞称为诱导的胚性决定细胞(induced embryogenically deter-reined cell)。并不是所有的细胞均可诱导成为胚性决定细胞。崔凯荣和戴若兰(2000)在对多种植物细胞离体培养中发现，体细胞胚的形成多通过间接途径产生。

在植物组织培养中，如何区别早期的芽和胚状体是我们常常碰到的一个问题。由于胚状体发生和器官发生均可起源于愈伤组织或者直接来自于外植体，特别从外观上，常常它们均有光滑、圆形突起似形状，因此这两种再生苗的途径常易混淆。但是，对诱导体细胞胚胎发生和诱导器官发生仍然可以加以区分。在组织学上，通过体细胞发育形成的胚状体与直接发育形成器官具有三个明显的不同特征。第一个是胚状体具有两极性(polarity)，即在发育的早期阶段，从其方向相反的两端分化出茎端和根端。胚性细胞第一次分裂多为不均等分裂，形成顶细胞和基细胞。其后由较小的顶细胞继续分裂形成多细胞原胚，而较大的基细胞进行少数几次分裂成为胚柄部分，这在形态上就具有了明显的两极性。其发育过程与合子胚相似，结构完整，就像一颗种子。体细胞胚一旦形成后，大多可生长为小植株，成苗率高。为此人们将发育至一定时期的体细胞胚制作成人工种子，以达到快速繁殖优良种质的目的。第二个是在组织学上，胚状体的维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上的联系，出现所谓生理上的隔离(physiological isolation)现象。与胚状体的发育不同，器官发生具有单极的芽和根，往往与母体植株或愈伤组织中形成的维管组织相连接。在多种植物体细胞胚胎发生中都能观察到，细胞开始分裂时很快就形成明显的细胞界限，到二细胞至多细胞原胚期，细胞壁加厚，与其他细胞隔开，而且随着体细胞胚的发育，周围细胞似乎处于解体状态，使隔离更加明显，因而很容易与原组织分离。表明体细胞胚与合子胚相似，从一开始便是一个完整的植物体雏形。它处于相对独立状态，可能便于细胞分化和全能性表达。体细胞胚可通过根端或类似胚柄的结构从外植体或愈伤组织中吸取营养，在适宜条件下长成一个独立的植株。第三个是胚状体的维管组织分布呈独立的“Y'，字形。而不定根或芽的情况则明显不同，它们与外植体或愈伤组织中形成的维管分子往往是相连的。

据不完全统计，在做过离体培养研究的1000多种高等植物中，植株的再生绝大多数是通过体细胞胚胎发生途径形成的。而且越来越多的研究表明，植物体细胞在离体培养中，通过体细胞胚胎发生途径形成再生植株已是极其普遍的现象，并认为该发生途径是植物体细胞在离体培养条件下的一个基本发育途径。除了植株的体细胞外，其他细胞(如小孢子等）在离体培养条件下也可以被诱导产生胚状体结构，并可进一步发育成为单倍体植株。如果对它进行染色体加倍处理，就可成长为能正常开花结实的二倍体植株。可以这么说，各类植物的不同器官、组织以及二倍体和单倍体细胞均有可能诱导胚状体结构而完成形态发生过程。

体细胞胚胎发生途径比器官发生途径再生植株有着明显的优点。①体细胞胚状体是一种具有根尖、芽尖的两极结构物，它具备发育成植株所必需的两种分生组织。在器官发生上，根与叶的发育经常是相互排斥的，所以为了获得完整再生植株，培养过程中变换培养基是需要的。但细胞或者组织的转移相当耗费人力、物力，并且增加污染概率。②体细胞胚状体产生的数量比器官发生形成的不定芽的数量多，能够繁育出大量的植株；而且，胚状体可制成人工种子，便于保存和运输。无疑，通过胚胎发生再生植株是组织培养应用于育种实践的一个相当有吸引力的途径。器官和胚状体的发生均可直接来自于外植体或者起源于愈伤组织，所以通过这两种途径再生的植株常易混淆，表3-1总结了两种再生途径的区别。

表3-1植株再生通过体细胞胚胎发生与器官发生两种途径的主要区别(薛庆善，2001)