药品检测中几个应用的具体例子如下。

例1-1 水溶性维生素的分析

图1-11 水溶性维生素分析谱图

样品：按出峰顺序依次为VC、VB1和VB6

流动相：A为0.1％TFA水溶液；B为0.1％ TFA的CAN溶液；A：B=97：3

波长：280nm

流速：1 mL/min

柱温：30℃

例1-2 中药黄连(味连)中季铵型生物碱的分析

图1-12 黄连中季铵型生物碱的分析谱图

流动相条件：0. 1％ TFA的乙腈-水(25：75)

例1-3 食品中合成着色剂(柠檬黄)的测定

图1-13 柠檬黄的测定谱图

色谱柱：C18，4.6mm×25cm，5um

流动相：A：甲醇B：乙酸铵溶液(pH=4.0，0.02mol/L)

进样量:10uL

例1-4 HPLC在三聚氰胺检测中的应用

第一，三聚氰胺是什么？

三聚氰胺简称三胺，学名三氨三嗪，别名密胺、氰尿酰胺，是一种重要的氮杂环有机化工原料，白色结晶粉末，无味。它常被用于生产塑料、胶水和阻燃剂。在部分亚洲国家，也被用以制造化肥。三聚氰胺是一种禁止用于宠物食品及动物饲料的化学物质，动物食用后，可以发生肾衰竭，并导致死亡。

第二，什么是“蛋白精”？

“蛋白精”是以三聚氰胺废料、羟甲基羧基氮等为原料的一类假蛋白饲料，主要为含氮杂环化合物，属于非蛋白质含氮化合物，主要用于工业生产。“蛋白精”在饲料中不能被动物所吸收，它降低了饲料中可吸收的真蛋白质含量，对动物会产生危害，是饲料和动物产品安全领域防范的重点。以“三聚氰胺”及其废料、羟甲基羧基氮等为原料的一类添加物，不允许在任何饲料中使用。当然更不能在人类食品中出现！

第三，为何添加“蛋白精”？

(1)“蛋白精”的最大特点是含氮量很高。含氮量可达到66％！折合成粗蛋白含量可达到400％！在植物蛋白粉中增加1个百分点的三聚氰胺，用凯氏定氮法测定时，蛋白质虚涨4个百分点。所以不法商就利用“蛋白精”来牟取暴利。有的牛奶中含三聚氰胺达54％！

(2)“蛋白精”为白色粉末，容易被染色，不容易发现。

只能用特定的检测仪器和检测方法才能检出。很多企业用凯氏定氮法测定粗蛋白含量；因为凯氏定氮法只能测出含氮量，而无法测出氮的来源，所以，在不知情的情况下，使用了含有“蛋白精”的蛋白类原料，成为受害者。

第四，“蛋白精”对人、畜的危害。

三聚氰胺在体内形成盐，微溶于水，在人体内主要通过肾脏排泄，在排泄过程中因为它微溶于水，容易在尿道、肾小管里沉淀，引发人和动物的膀胱炎、膀胱结石、肾脏炎等，对人危害很大。但未发现对人有致癌作用。

第五，三聚氰胺的检测方法。

目前检测奶粉和食品中的蛋白质含量，最普遍的是采用凯氏定氮法；该方法是通过测定氮的含量，间接反映样品中的蛋白质含量。

蛋白质主要由氨基酸组成，含氮量一般来讲，最多不超过30％。若以平均为16％计算，则品牌奶粉与牛奶中的含氮量分别为2.88％和0.45％左右。而三聚氰胺中的氮含量为66.67％，接近奶粉的23倍、牛奶的150倍！

三聚氰胺不是食品添加剂，食品行业很少有人会想到对它进行检测。检测的难度也较大，一般的卫生监督部门也不具备对三聚氰胺的检测能力。

目前对三聚氰胺的具体检测方法，除凯氏定氮法外，还有很多种。2008年提供国家标准评审的方法就有128种。下面介绍几种。

(1)固相萃取(SPE)法。

这里的关键是两条：①固相萃取柱的选择，因为三聚氰胺呈弱碱性(弱阳离子化合物)，净化过程一般选择阳离子交换柱。②样品的前处理(包括标准样品配制、样品的提取、样品的净化等)。

(2)LC-UV测定法。

三聚氰胺在传统的C₁₈柱上保留很差，需要用离子对试剂色谱方法才能有好的保留与分离。按照美国FDA和中国农业部的检测方法，采用亲水型色谱柱，能得到良好的结果。

LC-UV方法又有很多种。

①美国FDA的方法：

色谱柱：Venusil ASB C8 4.6×250mm

缓冲液：10mm柠檬酸，10mm辛烷磺酸钠，pH=3

流动相：缓冲液：乙腈=85：15

流速：1.0mL/mim

柱温：40℃

波长：240nm

进样量：样品用缓冲液溶解成约0.l mg/mL，进10uL

②中国农业部的方法：

色谱柱：Venusil ASB C18 4.6×250mm

缓冲液：10mm柠檬酸，10mM庚烷磺酸钠

流动相：缓冲液：乙腈=85：15

流速：1.0mL/mim

柱温：40℃

波长：240nm

进样量：样品用缓冲液溶解成约0.1mg/mL，进10uL

③中国最新的三聚氰胺的检测国家标准。

我国在128种快速检测方法中，进行初审和现场统一测试；经过10多家实验室确证，并经专家组审查通过，确定了我国国家标准为《原料乳三聚氰胺的快速检测液相色谱法》。检测范围0.3～100mg/kg；检测限0.05mg/kg。我国北京普析通用公司的L6(现已升级为L600) HPLC，成为参加《原料乳三聚氰胺快速测定—液相色谱法》国家标准起草的唯一国产品牌 HPLC。

④北京普析用公司的俞宏伟等，在国家建标过程中，采用北京普析通用公司的L6-2系列高效液相色谱仪，建立了奶粉/牛奶中三聚氰胺的HPLC-UV检测方法；奶中的三聚氰胺经1％三氯乙酸溶液提取，提取液加乙酸铅溶液沉淀蛋白，离心后上清液经混合型阳离子交换固相萃取柱(Cleanert PCX，60mg/3mL)净化，洗脱液吹干后定容，用L6-2高效液相色谱仪进行测定，最低检测限为0.0416mg/L，优于国外同类产品分析检测的结果；回收率为95.87％～105.2％，1～50ppm有良好的线性关系(R2=0.9996)。结果表明，该方法简便、快捷、准确，适合大批量样品的测定。

(3) LC-MS测定法。

色谱柱：Venusil ASB系列亲水色谱柱(C8或C18)

缓冲液：10mM NH4AC

流动相：缓冲液：CAN=95：5

流速：1.0mL/mim

柱温：40℃

波长：240nm

进样量：先用70％ CAN溶解成约1 mg/mL，再用CAN稀成0.1mg/mL，进10uL

我们国家卫生部、质检总局等5个部门联合发布公告，制定三聚氰胺在乳与乳制品中的临时管理限量值。其中婴幼儿配方乳粉中三聚氰胺的限量值为1mg/kg；液态乳(包括原料乳)、奶粉、其他配方乳粉中的三聚氰胺的限量值为2.5 mg/kg；含乳15％以上的其他食品中三聚氰胺的限量值2.5mg/kg，高于2.5mg/kg的产品一律不得销售。

下面介绍三聚氰胺的家庭测试方法。

(1)按照平常食用量和方法，用热水冲奶粉，充分搅拌到不见固块，然后放入冰箱，待牛奶静置降温。

(2)准备黑布一块，空杯一个，组成过滤器。

(3)用黑布过滤牛奶。

(4)如果有白色固体滤出，则用清水冲洗3～5次，以便排除其他可溶物的存在。

(5)如果冲洗后发现有白色晶体，可将晶体放入清水中，该晶体如果沉入水底，那就很可能是三聚氰胺。

相关链接：HPLC的应用及其最新进展（二）