6 试样的制备与保存

6.1 试样的制备

取有代表性样品500g，绞碎后搅拌均匀，制成实验室样品。试样分为两份，置于样品盒中，密封，并做上标记。

6.2 试样保存

将试样于-18℃下保存。

7 测定步骤

7.1 混合基质标准校准溶液的制备

7.1.1 样品称取

称取5个阴性样品，每个样品为5g(精确到0.1g)，将上述样品置于50 mL离心管(5.10)中，分别加入适量混合标准工作溶液(4.18)，使各被测组分玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烷雌酚、己烯雌酚和双烯雌酚的浓度分别为2.5ng/mL、5.0ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL。再分别加入适量内标标准工作溶液(4.20)，使其浓度均为10ng/mL。

7.1.2 提取

加入20 mL叔丁基甲基醚(4.2)，在10000r/min均质1min, 3000r/min离心5 min，将上清液全部转移至另一50 mL具塞离心管(5.10)中备用。离心管中的残渣置于通风橱中挥发30 min，加入15 mL乙酸盐缓冲液(4.12)，高速均质1 min; 3 000r/min离心5 min，将上清液全部转移至另一25 mL具塞试管(5.10)中，并在氮吹仪上于40℃水浴中吹去残余叔丁基甲基醚后，加入80 uL β-葡糖苷酸酶(4.16)混匀，于52℃烘箱中放置过夜。在此缓冲溶液中加入氢氧化钠溶液(4.11)将溶液pH值调至7，加入10 mL叔丁基甲基醚，充分混合，3000r/min离心2 min。移取叔丁基甲基醚层与前述的叔丁基甲基醚提取液混合，在氮吹仪上于40℃水浴中吹干。加入1 mL溶解液(4.13)，涡旋30s溶解，待净化。

7.1.3 净化

固相萃取净化条件：用6 mL正己烷分两次预洗硅胶柱(4.23)，流速均为4 mL/min。上样，流速为2 mL/min，在样品试管中加入3 mL淋洗液(4.14)，混合后过柱，流速为2 mL/min，用3 mL淋洗液以3 mL/min的速度淋洗，加入2 mL空气以4 mL/min的速度吹过硅胶柱。用6 mL洗脱液(4.15)洗脱，流速为2 mL/min，加入2 mL空气以6 mL/min的速度吹过硅胶柱：收集洗脱液。将洗脱液在氮吹仪上于40℃水浴中吹干，加入1 mL流动相，涡旋30 s溶解。溶液过0.2 um滤膜后，供液相色谱-串联质谱测定。

7.2 实测样品溶液的制备

称取待测样品5g(精确到0.1g)于50 mL离心管中，加入内标土作溶液，使其最终定容浓度均为10 ng/mL。按7.1.2和7.1.3操作。

7.3 空白基质溶液的制备

称取阴性样品5g(精确到0.1g)于50 mL离心管中，按7.1.2和7.1.3操作。

7.4 测定条件

7.4.1 液相色谱参考条件

a)色谱柱：ZORBAX Eclipse. SB-C8, 3.5um,150mm×4.6 mm(内径)或相当者；

b)柱温：25℃；

c)流动相：乙腈-水(7+3)；

d)流速：0.5mL/min;

e)进样量：50 uL。

7.4.2 质谱参考条件

a)离子化方式：电喷雾电离；

b)扫描方式：负离子扫描；

c)检测方式：多反应监测(MRM)；

d)离子源温度：350℃；

e)雾化气压力：0.083 MPa;

f)气帘气压力：0.1240 MPa;

g)辅助气1压力：0.2756 MPa;

h)辅助气2压力：0.2412 MPa;

i)喷雾器电流：-5 uA;

J)电喷雾电压：-4500V;

k)定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压见表1。

表15 种激素及代谢物的定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压

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文章来源：《常用兽药残留量检测方法》

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