4 防止污染措施

防止污染措施应符合GB/T 19495.2的规定。

5 抽样与制样

抽样与制样方法应符合GB/T 19495.7和GB % T 19495.3中的相关规定。

6 测定方法

6.1 原理

对样品进行DNA提取和纯化，使之适用于PCR检测技术，通过普通PCR或实时荧光PCR，检测其中是否含有各种外源基因．达到对食品中转基因植物成分定性PCR检测的目的。

6.2 主要仪器

6.2.1 均质器(可拆卸、可清洗、可高压灭菌)或研钵。

6.2.2 电子天平：感量0.001g。

6.2.3 高速冷冻离心机(最高转速55000g)。

6.2.4 台式离心机(最高转速15000g)。

6.2.5 微型个人离心机。

6.2.6 双温水浴(37℃±1℃、 65℃±1℃)。

6.2.7 制冰机。

6.2.8 涡旋振荡器。

6.2.9 冰箱(2℃～8℃、-20℃、-80℃)。

6.2.10 超纯水发生器(分子生物学级别)。

6.2.11 双蒸水器。

6.2.12 生物安全柜。

6.2.13 高压灭菌锅。

6.2.14 核酸真空干燥系统。

6.2.15 核酸蛋白分析仪。

6.2.16PCR仪。

6.2.17 实时荧光PCR仪。

6.2.18 电泳仪。

6.2.19 凝胶成像仪。

6.2.20 微量可调移液器及配套吸头(2.5uL～10uL、2 uL～20uL、10uL～100uL、50uL～200uL、100 uL～1000uL、500uL～5000uL)。

6.2.21 离心管(1.5 mL、2mL、15 mL、50 mL)。

6.2.22 光化学PCR反应管。

6.3 主要试剂

6.3.1 除另有规定外，所有实验使用的试剂等级应为不含DNA和DNase的分析纯或生化试剂。条件许可的情况下推荐使用优级纯试剂。试剂的选购、验收、贮存应符合GB/ T 27025的规定。

6.3.2 实验用水：应符合GB/T 6682中一级水的规格。去离子水电阻应达到18.2 SΩ。

6.3.3 琼脂糖。

6.3.4 RNase A酶溶液：冻千品，不含DNase,用高压灭菌的去离子水或双蒸水溶解为10g/L的溶液，分装后于-20℃保存．避免反复冻融。

6.3.5 CTAB-1提取缓冲液：CTAB 20g/L，氯化钠81.9g/L, Tris 12.1g/L, Na₂-EDTA 7.5g/L,PVP-40 20g/L，pH 8.0，高压灭菌。使用前加入终浓度为9％的β-巯基乙醇。

6.3.6 CTAB-2提取缓冲液：CTAB 20g/L， 氯化钠81.9g/L，Tris 12.1g/L，Na₂-EDTA 7.5g/L，pH 8.0，高压灭菌。

6.3.7 CTAB沉淀液：CTAB 5g/L,氯化钠2.5g/L, pH 8.0，高压灭菌。

6.3.8 氯化钠溶液：1.2 mol/L。

6.3.9 蛋白酶K溶液：冻干品，用高压灭菌的去离子水或双蒸水溶解为20 mg/mL的溶液，分装后于-20℃保存，避免反复冻融。

6.3.10 淀粉酶溶液：冻干品，用高压灭菌的去离子水或双蒸水溶解为10 mg/mL的溶液，分装后于-20℃保存，避免反复冻融。

6.3.11TE缓冲液：Tris 1.21g/L, Na₂-EDTA 0.372g/L, pH 8.0。

6.3.12 无水乙醇、异丙醇等有机试剂。

6.3.13 商品化植物基因组DNA提取纯化试剂盒。

6.3.14 10×PCR缓冲液：氯化钾100 mmol/L，硫酸铵160 mmol/L，硫酸镁20 mmol/L, Tris-HCI(pH 8.8)200 mmol/L，Triton X-100 1％，BSA 1 mg/mL。

6.3.15 氯化镁溶液：2.5 mmol/Lo

6.3.16 dNTP溶液(dGTP、dCTP、dATP、dTTP或dUTP)：各2.5 mmol/L。

6.3.17Taq酶。

6.3.18 UNG酶(以dUTP代替dTTP时)。

6.3.19 50×TAE电泳缓冲液或5×TBE电泳缓冲液：50×TAE电泳缓冲液(pH8.5):Tris 242g/L,冰乙酸57.1 mL/L, EDTA 0.1mol/L; 5×TBE电泳缓冲液：Tris 54g/L,硼酸275 g/L, EDTA(pH8.0)0.01 mol/L。

6.3.20 10×电泳上样缓冲液：Ficoll 400 20% , EDTA(PH8.0)0.1 mol/L, SDS 1.9%,溴酚蓝0.25％,二甲苯青0.25％。

6.3.21 引物和探针：食品中转基因植物成分定性PCR检测所用引物序列和探针序列见表1和表2。

表1 食品中转基因植物成分普通PCR检测所用引物序列

表2  食品中转基因植物成分实时荧光PCR检测所用引物序列和探针序列

相关链接：食品中转基因植物成分定性PCR检测方法（一）

文章来源：《食品化妆品检验卷无机元素和放射元素及其他检测方法》

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