6.4 检测步骤

6.4.1 对照设置

检测过程中应设置核酸提取空白对照、PCR扩增试剂空白对照、PCR扩增阴性目标DNA对照、PCR扩增阳性目标DNA对照，具体方式按照GB/T 19495.2中的相关规定。

6.4.2 待检样品的制备

6.4.2.1 器具清洁和灭菌

所有制备样品使用的器具在使用前应充分清洗或使用一次性用品，可经过121℃、30 min高压灭菌。

6.4.2.2 样品前处理

加工食品可能富含盐、糖、植物色素和发酵产生的有色物质等，会影响下游实验操作，应通过洗涤方式的样品前处理尽量去除样品中的盐、糖和色素。取适量样品加入50 mL离心管，加入约2倍体积的双蒸水，上下颠倒充分混匀，7200g离心5 min并弃去上清液，重新加入约2倍体积的双蒸水，上下颠倒混匀，7200g离心5 min并弃去上清液：重复洗涤操作步骤3次～5次。乳浊或悬浊状的液体食品样品，如茄汁、番茄酱(稀)、豆奶、豆浆等，可以通过物理方式破坏胶体稳定性并分离、浓缩。取适量样品加入2mL离心管，7200g离心5 min并弃去上清液；再次加入适量样品，7200g离心5 min并弃去上清液；重复上述操作步骤3次～5次。

6.4.2.3 样品均质

采用均质器、搅拌机、研钵等实验器具对样品进行均质处理。

6.4.3 DNA提取和纯化

6.4.3.1 空白对照的设置

DNA提取和纯化过程应设置核酸提取空白对照，具体方式按照GB/T 19495.2中相关规定进行。

6.4.3.2DNA溶液的保存

提取和纯化后的DNA溶液长期保存应储存-20℃或低于-20℃。

6.4.3.3CTAB法

按照GB/T 19495.3中规定的方法进行。

6.4.3.4 试剂盒法

采用商品化的植物基因组DNA提取纯化试剂盒，按照试剂盒使用说明提取DNA。

6.4.4 DNA定量

DNA定量方法按照GB/T 19495.3中相关规定进行。

6.4.5 定性PCR检测

6.4.5.1 对照设置

PCR检测过程中应设置PCR扩增试剂空白对照、PCR扩增阴性目标DNA对照、PCR扩增阳性目标DNA对照，并对DNA提取和纯化过程中设置的核酸提取空白对照同时进行PCR检测，具体方式按照GB/T 19495.2中相关规定。

6.4.5.2 PCR分类

食品中转基因植物成分的定性PCR检测，按照PCR反应类型，分为普通PCR检测和实时荧光PCR检测。普通PCR检测阳性结果应进一步进行确证实验，实时荧光PCR检测阳性结果无需进行其他确证实验。

6.4.5.3 内源基因检测

为降低检测成本、避免无效操作，定性PCR检测时可先进行内源基因检测，检测结果阳性表明从样品中提取出适宜进行PCR检测的DNA，可以进行外源基因检测；否则表明未能从样品中提取出适宜进行PCR检测的DNA，应重新进行DNA提取和纯化。

6.4.5.4 普通PCR检测

6.4.5.4.1 适用范围

普通PCR检测适用于DNA破碎程度较低、DNA含量较高的食品样品，如食品原料和粗加工食品。

6.4.5.4.2 普通PCR反应体系

普通PCR反应体系见表3。每个样品进行普通PCR检测时应设置2个平行。

表3 普通PCR反应体系

6.4.5.4.3 普通PCR反应循环参数

普通PCR反应循环参数见表4。使用不同PCR仪，可对参数作适当调整。

表4 普通PCR反应循环参数

6.4.5.4.4 普通PCR扩增产物的凝胶电泳检测

用1×TAE或1×TBE电泳缓冲液制备2％的琼脂糖凝胶，在凝胶55℃～60℃时加入EB至终浓度0.5ug/mL或其他染色剂至其要求的工作浓度。将PCR扩增产物与上样缓冲液混合，混合后上样缓冲液浓度为1× 。将混合物点样，并根据PCR扩增口标片段大小选择合适的DNA分子量标记点样。8V/cm～10 V/cm恒压电泳20 min～40 min。用凝胶成像仪观察、记录并分析结果。

6.4.5.4.5 确证实验

普通PCR扩增产物经凝胶电泳检测为阳性结果的，还应通过下列的方法之一进行确证：

—用特异DNA探针进行杂交；

— PCR产物的限制性内切酶酶切分析；

— PCR产物序列测定；

—实时荧光PCR检测(采用6.4.4.2的方法)；

—其他验证方法。

文章来源：《食品化妆品检验卷无机元素和放射元素及其他检测方法》

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