6.4.5.5 实时荧光PCR检测

6.4.5.5.1 适用范围

实时荧光PCR检测适用于DNA破碎程度较高、DNA含量较低的食品样品，如食品成品和深加工食品。

6.4.5.5.2 实时荧光PCR反应体系。实时荧光PCR反应体系见表5。每个样品进行实时荧光PCR检测时应设置2个平行。

表5 实时荧光PCR反应体系

6.4.5.5.3 实时荧光PCR反应循环参数

实时荧光PCR反应循环参数见表6。使用不同PCR仪，可对参数作适当调整。

表6 实时荧光PCR反应循环参数

6.4.5.5.4 仪器检测通道的选择

设置PCR反应管荧光信号收集条件，应与探针标记的报告基团一致。具体设置方法可参照仪器使用说明书。

6.5 结果判断

6.5.1 普通PCR检测结果判断

6.5.1.1 质量控制

6.5.1.1.1 基本原则

实验中设置的各种对照PCR扩增产物凝胶电泳检测结果应符合以下情况。否则，任一种对照如果出现非6.5.1.1.2

6.5.1.1.4 所述正常结果，应重做实验。

6.5.1.1.2 核酸提取空白对照和PCR扩增试剂空白对照

内源基因检测结果阴性，外源基因检测结果阴性。

6.5.1.1.3PCR扩增阴性目标DNA对照

内源基因检测结果阳性，外源基因检测结果阴性。

6.5.1.1.4PCR扩增阳性目标DNA对照

内源基因检测结果阳性，外源基因检测结果阳性。

6.5.1.2结果判断

6.5.1.2.1样品内源基因检测结果阴性，表明未能从样品中提取出适宜进行普通PCR检测的DNA或所提取的DNA中存在PCR反应抑制因子，应重新提取DNA。

6.5.1.2.2 样品内源基因检测结果阳性，外源基因检测结果阴性，表明从样品中提取出适宜进行普通PCR检测的DNA，可以判断样品中未检出XXX基因。

6.5.1.2.3 样品内源基因检测结果和外源检测结果均为阳性，表明从样品中提取出适宜进行普通PCR检测的DNA，且样品DNA中可能含有XXX基因，应进一步进行确证实验。确证实验结果阳性，可以判断样品中检出XXX基因。否则，可以判断样品中未检出XXX基因。

6.5.2 实时荧光PCR检测结果判断

6.5.2.1 基线和阈值的设置

实时荧光PCR反应结束并分析结果时，应设置基线和闽值。基线范围设置在3个～15个循环。基线阈值设置在基线刚好超过正常阴性目标DNA对照扩增曲线最高点且Ct=40，通常情况下可以采用仪器默认的基线阈值，即采用3个～15个循环的阴性目标DNA对照的10倍标准差作为阈值。

6.5.2.2 质量控制

6.5.2.2.1 基本原则

实验中设置的各种对照PCR检测结果应符合以下情况。否则，任一种对照如果出现非下述正常结果，应重做实验。

6.5.2.2.2 核酸提取空白对照和PCR扩增试剂对照空白对照

外源基因检测结果Ct≥40，内源基因检测结果Ct≥40。

6.5.2.2.3PCR扩增阴性目标DNA对照

外源基因检测结果Ct≥40，内源基因检测结果20≤Ct≤36。

6.5.2.2.4PCR扩增阳性目标DNA对照

外源基因检测结果Ct≤36。

6.5.2.3 结果判断和表述

6.5.2.3.1 样品外源基因2个平行样检测结果Ct≥40，内源基因检测20≤Ct≤36并出现典型的扩增曲线，同时各种实验对照结果正常，此时可以判断样品未检出XXX基因，结果表述为未检出XXX基因。

6.5.2.3.2 样品外源基因至少1个平行样检测结果36＜Ct＜40并出现典型的扩增曲线，内源基因检测20≤Ct≤36并出现典型的扩增曲线，同时各种实验对照结果正常，此时应适当增加DNA模板量后重做实时荧光PCR检测。再次检测结果外源基因仍然Ct<40并出现典型的扩增曲线，同时各种实验对照结果正常，可以判断样品检出XXX基因；再次检测结果外源基因Ct≥40，同时各种实验对照结果正常，可以判断样品未检出XXX基因，结果表述为未检出XXX基因。

6.5.2.3.3 待测样品外源基因2个平行样检测结果Ct≤36并出现典型的扩增曲线，内源基因检测20≤Ct≤36并出现典型的扩增曲线，同时各种实验对照结果正常，此时可以判断样品检出XXX基因，结果表述为未检出XXX基因。

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文章来源：《食品化妆品检验卷无机元素和放射元素及其他检测方法》

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