6.4 检测步骤

6.4.1 待检样品的制备

6.4.1.1 样品的设置

检测过程中设置核酸提取空白对照、PCR扩增空白对照、PCR扩增阴性对照、PCR扩增阳性对照。

6.4.1.2 样品前处理

加工食品可能富含盐、糖、植物色素和发酵产生的有色物质等，会影响下游实验操作，应通过洗涤方式的样品前处理尽量去除样品中的盐、糖和色素。具体步骤是：取约500 mg样品加入50 mL离心管，加入约2倍体积的双蒸水，上下颠倒充分混匀，8000g离心5min并弃去上清液，重新加入约2倍体积的双蒸水，上下颠倒混匀，8000g离心5 min并弃去上清液，必要时用三氯甲烷清洗样品1次。悬乳浊或浊状的液体食品样品，如酱汁等，可以通过物理方式破坏胶体稳定性并分离、浓缩。取适量样品加入2 mL离心管，8000g离心5 min并弃去上清液，再次加入适量样品，8000g离心5 min并弃去上清液，必要时用三氯甲烷清洗样品1次。

6.4.1.3 样品均质

采用均质器、搅拌机、研钵等实验器具对样品进行均质处理。

6.4.2 DNA提取和纯化

6.4.2.1 CTAB法

称取500 mg样品于15 mL离心管中，加入5 mL CTAB裂解液和20 uL蛋白酶K溶液，65℃温育1h，期间不时振荡混匀，应保证样品自由悬浮于液体中，必要时，再加入适量CTAB裂解液；8000g离心5 min，取1 mL上清于2 mL、离心管中，加700uL-三氯甲烷，旋涡振荡30 s, 14500g离心 10 min，收集600uL～650uL，上清液到新的2 mL离心管中，加入2倍体积的CTAB沉淀液，室温60 min;14500g离心5 min，去除上清液，加350 uL氯化钠溶液溶解沉淀，加等体积三氯甲烷，旋涡振荡30 s,14300g离心10 min，转移上清液到新的离心管，加0.8倍体积异丙醇，室温20 min, 14500g离心10 min，加500uL 70％乙醇水溶液，旋涡振荡30 s,14500g离心10 min，去除上清液，室温条件下过夜或者60℃烘15 min～25 min，注意不要让沉淀过干。加50 uL双蒸水溶解沉淀，-20℃保存。

6.4.2.2 试剂盒法

采用商品化的食品基因组DNA提取纯化试剂盒，按照试剂盒使用说明提取DNA。

6.4.3 DNA定量

取10 uL DNA溶液加蒸馏水稀释至1 mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260 nm和280 nm处的吸光值。DNA的浓度按照式(1)计算，当OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.5～2.1之间时，适宜于PCR扩增。扩增前将所有样品DNA调至约10 ng/uL～50 ng/uL。

c＝A×N×50/1000······(1)

式中：

c—DNA浓度，单位为纳克每微升(ng/uL) ;

A—260 nm处的吸光值；

N—核酸稀释倍数。

6.4.4 实时荧光PCR检测

6.4.4.1 实时荧光PCR反应体系

实时荧光PCR反应体系见表2。每个样品设置2个平行。

表2 实时荧光定性PCR反应体系

6.4.4.2 实时荧光PCR反应循环参数

实时荧光PCR反应循环参数见表3。使用不同PCR仪，可对参数作适当调整。

表3 实时荧光定性PCR反应循环参数

6.4.4.3 仪器检测通道的选择

设置PCR反应管荧光信号收集条件，应与探针标记的报告基团一致。具体设置方法可参照仪器使用说明书。

6.5 结果判断与表述

6.5.1PCR有效性判定

空白对照：无FAM荧光信号，Ct值40.0；阴性对照：无FAM荧光信号，Ct值40.0；阳性对照：有FAM荧光信号，Ct值镇30.0。

6.5.2DNA提取有效性判定

在符合6.5.1的条件下，样品的MGH体系有FAM荧光信号，Ct值≤35.0。

6.5.3 检测结果判定与表述

在符合6.5.1和6.5.2的条件下，样品BGH体系有FAM荧光信号，Ct值≤35.0，则判定为BGH阳性，表述为检出牛成分；样品BGH体系无FAM荧光信号，Ct值40.0，则判定为BGH阴性，表述为未检出牛成分；样品BGH体系有FAM荧光信号，35.0＜Ct值＜40.0，则需重复实验。重复实验中，样品BGH体系无FAM荧光信号，Ct值40.0，则判定为BGH阴性，表述为未检出牛成分；重复实验中，样品BGH体系有FAM荧光信号，Ct值＜40.0，则判定为BGH阳性，表述为检出牛成分。

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文章来源：《食品化妆品检验卷无机元素和放射元素及其他检测方法》

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