7 测定步骤

7.1 样液的制备

称取10.0g试样于均质杯内，加入90 mL 50％甲醇，10000r/min均质2 min，转入蒸馏瓶中，用氢氧化钠溶液调至pH 8.0，随后90℃回流15 min，冷却后移入离心管中，以3 000 r/min离心20 min，取上清液作为试验样液。

7.2 芽孢悬液的制备

将试验菌种(4.10)接种于营养肉汤培养基试管内。经28℃±1℃培养18h±1h，取1 mL 菌液，加入盛有适量培养基Ⅰ的克氏瓶中，涂抹均匀；置培养箱28℃±1℃培养一周。镜检芽孢数达85％以上，用适量灭菌生理盐水洗下菌苔，于65℃恒温水浴中加热30 min，再以3000r/min离心10 min，弃去上清液，如此重复洗涤2次～3次，再于65℃水浴中加热30 min，最终用适量灭菌生理盐水稀释，制成芽孢悬液，置4℃冰箱保存。

7.3 芽孢悬液用量的确定

在实际测定前把不同量的芽孢悬液加到培养基Ⅱ中，制成平板，培养18h±1h，能使0.094 ug/mL标准工作液产生直径大于等于10 mm、清晰、完整的抑菌圈为最佳芽孢悬液用量。

7.4 检定用平板的制备

将培养基Ⅱ熔化后，冷却至45℃～50℃，加入适量芽孢悬液(从7.3测得)，混匀，取8 mL注入培养皿，使培养基均匀覆盖其底面，保持水平，待其凝固。所用平板应当天制备。

7.5 标准曲线的制备

用富拉磷标准工作液(4.6)制备标准曲线，以0.375 ug/mL浓度的标准工作液为参考浓度。每个标准工作液浓度取三个检定平板为一组，每个平板上置6个牛津杯，使牛津杯在半径为9.8 cm的圆面成60^o角间距，其中3个间隔位的牛津杯中加0.375 ug/mL参考浓度标准工作液，另3个间隔位的牛津杯加其他浓度的一种标准工作液。将陶瓦盖盖好，置28℃±1℃培养18 h～1h。培养后，取出平板，除去牛津杯，精确测量各个浓度的抑菌圈直径(精确到0.1mm)。4个浓度标准工作液共12个检定平板，用于制备标准曲线。0.375 ug/mL参考浓度的标准工作液将得到36个数值，而其他标准工作液分别得到9个数值。分别求出每组3个平板上参考浓度的抑菌圈直径读数和其他浓度的抑菌圈直径读数的平均值。再求0.375 ug/mL参考浓度36个抑菌圈直径的平均值。用参考浓度的抑菌圈直径的总平均值减去每组平板参考浓度的抑菌圈直径平均值的差，即为每组平板的校正值。将校正后的值用式(1)和式(2)算出L和H点的直径，在半对数坐标纸上，以抑菌圈直径(mm)为纵坐标(算术级)，富拉磷标准工作液浓度(ug/mL)为横坐标(对数级)，通过L和H连一直线即为标准曲线。

式中：

L—标准曲线上最低浓度抑菌圈的直径，单位为毫米(mm)；

H—标准曲线上最高浓度抑菌圈的直径，单位为毫米(mm)；

c—参考浓度0.375 ug/mL的36个抑菌圈直径的平均值，单位为毫米(mm)；

a,b,d,e—分别表示标准曲线中其他标准浓度0.094 ug/mL、0.188 ug/mL、0.75 ug/mL、1.5 ug/mL的抑菌圈直径经校正后的平均值，单位为毫米(mm)。

7.6 样液的测定

每份样液用3个检定平板，在每个平板上放6个已灭菌的牛津杯(按制备标准曲线方法放置)，在相间隔3只牛津杯里注满试验样液．在剩余的3只牛津杯里分别注满富拉磷标准参考浓度工作液(0.375 ug/mL)。将陶瓦盖盖好，于28℃±1℃下培养18h±1h，然后取出平板，除去牛津杯。如有抑菌圈产生，准确测量抑菌圈直径(精确到0.1 mm)。

8 结果的计算和表述

8.1 如样液抑菌圈直径小于10 mm．即报告为“未检出”。

8.2 如样液抑菌圈直径大于等于10 mm，求出每组三个检定平板中的样液和参考浓度标准工作液抑菌圈直径的平均值，经校正后，从标准曲线上查出相应的富拉磷浓度，通过式(3)，计算试样中富拉磷残留量：

式中：

X—试样中富拉磷残留的含量，单位为毫克每千克(mg/kg) ;

c—从标准曲线上查出的样液中富拉磷浓度，单位为微克每毫升(ug/mL)；

m—每毫升最终样液所代表的试样量，单位为克(g)。

注：若测定结果为阳性，即所显抑菌圈的平均直径大于10 mm时，必要时，尚需进行确证实验(可用薄层色谱法或液相色谱串联质谱法)，以证明抑菌物确系富拉磷。

9 测定低限和回收率

9.1 测定低限

本方法的测定低限为0.94 mg/kg。

9.2 回收率

回收率试验数据：

—0.94 mg/kg时，回收率80.2％～93.6％；

—3.70 mg/kg时，回收率80.5％～95.3％;

—7.5 mg/kg时，回收率80.0％～91.7％。

相关链接：进出口肉品中富拉磷残留量检测方法（一）

文章来源：《食品化妆品检验卷无机元素和放射元素及其他检测方法》

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