6 测定步骤

6.1 提取

6.1.1 蜂蜜

称取5g试样(精确到0.01g)置于50 mL具塞离心管中，加入25 mL磷酸溶液(4.13),混匀，以6000 r/min离心7 min，上清液待净化用。

6.1.2 蜂王浆和王浆冻干粉

称取10g蜂王浆或3.3g王浆冻干粉(精确到0.01g)置于50 mL容量瓶中，加入40 mL磷酸溶液(4.13) ,混匀，再加入2 mL 50％三氯乙酸，用磷酸溶液(4.13)定容，轻轻混匀，将溶液转移到50 mL具塞离心管中，以6000r/min离心7 min，过滤。移取25 mL滤液，用饱和氢氧化钠溶液调pH为2.0，待净化用。

6.2 净化

6.2.1 苯磺酸型固相萃取柱净化

将上述待净化的清液转移至经预洗的苯磺酸型固相萃取柱(4.24)，用5 mL稀磷酸溶液(4.13)和10 mL水淋洗固相萃取柱，弃去全部淋出液，再用30 mL 0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液(4.14)洗脱。在洗脱液中加入5 mL 0.5 mol/L庚烷磺酸钠溶液，摇匀，用磷酸调pH为3.3。

6.2.2 Oasis HLB固相萃取柱净化

将上述溶液(6.2.1)移入经预洗的Oasis HLB固相萃取柱(4.25)，用5 mL稀磷酸溶液(4.13)淋洗，在真空负压下，减压抽干5 min，再用4 mL叔丁基甲醚-正己烷溶液(4.12)淋洗，同样减压抽干5 min，弃去全部淋出液。用5mL甲醇溶液以1.5 mL/min的流速洗脱链霉素和双氢链霉素，洗脱液在45℃以下水浴减压浓缩至近干，用0.01mol/L庚烷磺酸钠酸溶液溶解并定容至2.0 mL，混匀，供液相色谱-串联质谱仪测定。

6.3 测定

6.3.1 液相色谱-串联质谱条件

a)色谱柱：C₁₈,5um,150 mm×4.6 mm(内径)或相当者；

b)流动相0.3％乙酸水溶液：0.3％乙酸乙腈溶液(80：20，体积比)；

c)流速：400 uL/min；

d)进样量:30 uL；

e)离子源：电喷雾离子源；

f)扫描方式：正离子扫描；

g)检测方式：多反应监测；

h)雾化气、气帘气、辅助气、碰撞气均为高纯氮气或其他高纯气体；

6.3.2 色谱测定

根据试样中被测样液的含量情况，选取响应值相近的标准工作液进行色谱分析。标准工作液和样液中待测物的响应值均应在仪器线性响应范围内。

6.4 定性、定量

按照液相色谱-串联质谱条件测定样品和标准工作溶液，如果检测的质量色谱峰保留时间与标准品一致，定量测定时采用标准曲线法。定性时应当与浓度相当标准工作溶液的相对丰度一致，相对丰度允许偏差不超过表1规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物。

表1 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差

6.5 空白试验

除不加试样外，均按上述操作步骤进行。

7 结果计算和表述

用色谱数据处理机或用标准曲线按式(1)计算试样中链霉素或双氢链霉素残留含量，结果表述以链霉素和双氢链霉素之和计：

式中：

X—试样中链霉素或双氢链霉素的残留量，单位为毫克每千克(mg/kg);

c—从标准曲线上得到的待测液中链霉素或双氢链霉素的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL);

V—样液最终定容体积，单位为毫升(mL) ;

m—最终样液代表的试样质量，单位为克(g)。

8 测定低限(LOQ)和回收率

8.1 测定低限(LOQ)

本方法对蜂蜜和蜂王浆中链霉素和双氢链霉素的测定低限均为0.01 mg/kg(LOQ)。

8.2 回收率

回收率的实验数据(在不同添加浓度范围内)见表2。

表2 蜂蜜和蜂王浆中回收率的范围

相关链接：进出口蜂产品中链霉素、双氢链霉素残留量的检测方法(一)

文章来源：《食品化妆品检验卷无机元素和放射元素及其他检测方法》

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