检测步骤

1．小麦基因组DNA提取

第一法：CTAB法。

称取0.2g粉碎后的小麦试样于2.0mL离心管中，加入lmL CTAB裂解液，混匀在65℃水浴温育30min，不时振荡，12000r／min离心5min。小心取离心上清液至新的2.0mL 离心管中，加入等体积三氯甲烷一异戊醇，混匀后放置5min，重复离心5min。取离心上清液至另一新的2．0mL离心管中，再加入等体积三氯甲烷一异戊醇，混匀后放置5min，12000r/min再重复离心5min。小心吸取离心上清液至1．5mL离心管中，加入0．65倍体积4℃遇冷的异丙醇，混匀，4℃下12000r／min离心10min，小心弃掉上清液。加500μL 4℃预冷的70％乙醇洗涤一次，4℃下12000r／min离心5min，弃上清液，重复洗涤一次，室温或真空干燥沉淀。加入50μL TE缓冲液，4℃过夜或37℃保温lh溶解沉淀，4℃保存备用。每个实验样品 应制备两个测试样品和提取空白对照，同时提取DNA。

第二法．试剂龠法。

小麦总DNA的提取也可使用相应的市售DNA提取试剂盒。

2．DNA纯度和浓度的定量

样品中提取的DNA做适当稀释，放人紫外分光光度计的比色杯中，于260nm处测定其吸收峰，OD260＝50μg／mL双链DNA或38μg／mL单链DNA。紫外分光光度检测核酸浓度的最佳范围为2～50μg／mL，OD值应该在0.05～1范围内。PCR级DNA溶液OD260/OD280值为1.7～2.0，符合PCR级纯度要求。

3．质控设置

阴性对照：以非转基因小麦DNA为模板。阳性对照：采用含有目的基因序列的转基因小麦DNA为PCR反应的模板，或采用含有目的基因序列的质粒。空白对照：PCR试剂白对照(以水代替PCR模板)，提取空白对照。

4．PCR定性检测

(1)PCR扩增反应体系和参数PCR扩增反应体系和参数见表11—7和表11—8，反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当的调整。每个测试应设置两个平行反应。

(2)PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测 将适量10×TAE稀释成1×TAE溶液，配制溴化乙锭含量为0.5μg／mL的1％～2％琼脂糖凝胶。取10μL PCR产物，加2μL上样缓冲液，混匀，在琼脂糖凝胶孔内点样，用DNA Mar。ker判断PcR产物片段的大小。根据电泳槽长度调节电泳电压，一般控制在3～5V／cm，电泳时问根据溴酚蓝的移动位置来确定，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录。

(3)PCR结果判定

①小麦DNA提取液是否适合PCR扩增判断 用小麦内源Wx012(或GAG56D)基因对小麦DNA提取液进行PCR测试，阴性对照、阳性对照和试样DNA均应扩增出Wx012102 bp DNA片段或GAG56D 328 bp DNA的PCR产物。如果未见PCR扩增，则说明在DNA提取过程中未提取到可进行PCR测试的DNA，或DNA提取液中有抑制PCR反应的物质存在，应重新提取DNA，直到扩增出该PCR产物为止。

②小麦中转基因成分检测 对小麦样品DNA提取液进行外源基因的PCR检测，如果阴性对照和空白对照未出现扩增条带，阳性对照和试样DNA均出现预期大小的扩增条带(扩增片段长度见表11—5)，则可初步判断有可疑的外源基因，应进一步做实时荧光PCR等确证实验，然后依据确证实验结果进行最终报告。如果测试样品中未出现PCR扩增产物，则可直接判定试样中未检出该外源基因。

(4)确证实验 样品检测为阳性结果时需要用实时荧光PCR来确证。

5．实时荧光PCR定性检测

(1)实时荧光PCR反应体系及反应参数实时荧光PCR反应体系和反应参数，反应体系中各试剂的用量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当的调整。每个反应体系府设詈两个平行测试。

(2)实时荧光PCR结果判定

①实时荧光PCR质控标准 空白对照：无特异性扩增荧光增幅现象(无Ct值)。阴性对照：无特异性扩增荧光增幅现象(无Ct值)。阳性对照：外源基因检测Ct值小于或等于36。上述指标有一项不符合者，应重新做实时荧光PCR扩增。

②实时荧光PCR结果判定测试样品内源基因检测Ct值小于或等于36，外源基因检测Ct值大于或等于40，判断该样品不含所检的外源基因。测试样品内源基因检测Ct值小于或等于36，外源基因检测Ct值小于或等于36，判断该样品含有所检的外源基因。测试样外源基因检测Ct值在36～40，应调整模板浓度，重做实时荧光PCR。再次扩增后的外源基因Ct值仍小于40，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，则可判定为该样品检出转基因成分。再次扩增后的外源基因Ct值大于或等于40，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，则可判定为该样品未检出转基因成分。