6 分析步骤

6.1 试样处理

6.1.1 含淀粉的试样

称取混合均匀的固体试样约5g或液体试样约50g(精确到0.1mg)于250mL三角瓶中，加入1g a-淀粉酶(4.1),固体试样需用约50mL 45℃～50℃的水使其溶解，混合均匀后充氮，盖上瓶塞，置于60℃±2℃培养箱(5.6)内培养30min。

6.1.2 不含淀粉的试样

称取混合均匀的固体试样约10g或液体试样约50g(精确到0.1mg)于250mL三角瓶中，固体试样需用约50mL 45℃～50℃水使其溶解，混合均匀。

6.2 测定维生素D的试样需要同时做回收率实验。

6.3 待测液的制备

6.3.1 皂化：于上述处理的试样溶液中加入约100mL维生素C的乙醇溶液(4.10),充分混匀后加25mL氢氧化钾水溶液(4.5)混匀，放入磁力搅拌棒，充氮排出空气，盖上胶塞。1000mL的烧杯中加入约300mL的水，将烧杯放在恒温磁力搅拌器(5.3)上，当水温控制在53℃±2℃时，将三角瓶放入烧杯中，磁力搅拌皂化约45min后，取出立刻冷却到室温。

6.3.2 提取：用少量的水将皂化液全部转入500mL分液漏斗中，加入100mL石油醚(4.6),轻轻摇动，排气后盖好瓶塞，室温下振荡约10min后静置分层，将水相转入另一500mL分液漏斗中，按上述方法进行第二次萃取。合并醚液，用水洗至近中性。醚液通过无水硫酸钠过滤脱水，滤液收入500mL圆底烧瓶中，于旋转蒸发器上在40℃±2℃充氮条件下蒸至近干(绝不允许蒸干)。残渣用石油醚转移至10mL容量瓶中，定容。

6.3.3 从上述容量瓶中准确移取2.0mL石油醚溶液放入试管A中，再准确移取7.0mL石油醚溶液放入另一试管B中，将试管置于40℃±2℃的氮吹仪(5.4)中，将试管A和B中的石油醚吹干。向试管A中加50mL甲醇(4.7),振荡溶解残渣。向试管B中加2.0mL正己烷(4.8),振荡溶解残渣。再将试管A和试管B以不低于5000转/分钟的速度离心10min,取出静置至室温后待测。A管用来测定维生素A、E、B管用来测定维生素D。

6.4 测定

6.4.1 维生素A、E的测定

6.4.1.1 色谱参考条件

色谱柱：C₁₈柱，250mm×4.6mm,5um,或具同等性能的色谱柱。

流动相：甲醇(4.7)。

流速：1.0mL/min。

检测波长：维生素A：325nm；维生素E：294nm。

柱温：35℃±1℃。

进样量：20uL。

6.4.1.2 维生素A、E标准曲线的绘制

分别准确吸取维生素A标准储备液(4.11.1)0.50mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、2.50mL于50mL棕色容量瓶中，用乙醇定容至刻度混匀。此标准系列工作液浓度分别为1.00ug/mL、2.00ug/mL、3.00ng/mL、4.00ug/mL、5.00ug/mL。

分别准确吸取维生素E标准储备液(4.11.2)1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL于50mL棕色容量瓶中，用乙醇定容至刻度混匀。此标准系列工作液浓度分别为10.0ug/mL、20.0ug/mL、30.0ug/mL、40.0ug/mL、50.0ug/mL。

分别将维生素A、E标准工作液注入液相色谱仪中,得到峰高(或峰面积)。以峰高(或峰面积)为纵坐标，以维生素A、E标准工作液浓度为横坐标分别绘制维生素A、E标准曲线。6.4.1.3维生素A、E试样的测定将试液(6.3.3中A管)注入液相色谱仪中，得到峰高(或峰面积)，根据各自标准曲线得到待测溶液中维生素A、E的浓度。

6.4.2 维生素D的测定

6.4.2.1 维生素D待测液的净化

6.4.2.1.1 色谱参考条件。

色谱柱：硅胶柱，150mm×4.6mm,或具同等性能的色谱柱。

流动相：环己烷(4.9)与正己烷(4.8)按体积比1:1混合，并按体积分数0.8%加入异丙醇(4.3)。

流速：1mL/min。

波长：264nm。

柱温：35℃±1℃。

进样体积：500uL。

6.4.2.1.2 取约0.5mL维生素D标准储备液于10mL具塞试管中，在40℃±2℃的氮吹仪(5.4)上吹干。残渣用5mL正己烷振荡溶解。取该溶液50uL注入液相色谱仪中测定，确定维生素D保留时间。然后将500uL待测液(6.3.3中B管)注入液相色谱仪中，根据维生素D标准溶液保留时间收集维生素D馏分于试管C中。将试管C置于40℃±2℃条件下的氮吹仪中吹干，取出准确加入1.0mL甲醇(4.7),残渣振荡溶解，即为维生素D测定液。

6.4.2.2 维生素D测定液的测定

6.4.2.2.1 参考色谱条件

色谱柱：C₁₈柱，250mm×4.6mm,5um,或具同等性能的色谱柱。

流动相：甲醇(4.7)。

流速：1mL/min。

检测波长：264nm。

柱温：35℃±1℃。

进样量：100uL。

6.4.2.2.2 标准曲线的绘制

分别准确吸取维生素D₂(或D₃)标准储备液(4.11.3、4.11.4)0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL于100棕色容量瓶中，用乙醇定容至刻度混匀。此标准系列工作液浓度分别为0.200ug/mL、0.400ug/mL、0.600ug/mL、0.800ug/mL、1.000ug/mL。

分别将维生素D₂(或D₃)标准工作液注入液相色谱仪中，得到峰高(或峰面积)。以峰高(或峰面积)为纵坐标，以维生素D₂(或D₃)标准工作液浓度为横坐标分别绘制标准曲线。

6.4.2.2.3 维生素D试样的测定

吸取维生素D测定液(6.4.2.1中C管)100uL注入液相色谱仪中，得到峰高(或峰面积)，根据标准曲线得到维生素D测定液中维生素D₂(或D₃)的浓度。

维生素D回收率测定结果记为回收率校正因子f,代入测定结果计算公式(2),对维生素D含量测定结果进行校正。

相关链接：婴幼儿食品和乳品中维生素A、D、E的测定（一）

文章来源：《食品安全国家标准汇编检验方法（一）》

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