6 分析步骤

6.1 接种菌悬液的制备

6.1.1 将冻干菌株(4.1)活化后，转接到乳酸杆菌琼脂培养基(4.3.1)中，36℃±1℃培养过夜。再 转接2～3代来增强活力。然后再将其从固体培养上转接到乳酸杆菌肉汤培养基(4.3.2)中培养。

6.1.2 将乳酸杆菌肉汤中的培养液以2000转/分钟离心2min～3min,倾出上清液，加入10mL氯化钠溶液(4.7),混匀，再离心2 min～3 min,如此清洗3次～4次，吸适量该菌悬液于10mL氯化钠(4.7) 中，待测。

6.1.3 用分光光度计以氯化钠溶液(4.7)做空白，于550 nm波长下测菌悬液(6.1.2)的透光率，使 其透光率在60%～80%。

6.2 样品的处理

6.2.1 干粉样品

称取一定量样品(精确至0.0001g)于250 mL三角瓶中，该样品应含0.2ug～0.5ug生物素。继续 6.2.3步骤。

6.2.2 液体样品

吸一定量的液体样品于250mL三角瓶中，该样品应含0.2ug～0.5ug生物素。继续6.2.3步骤。

6.2.3 样品的提取

加入硫酸溶液(4.5)100mL,121℃水解30min,冷却后用氢氧化钠溶液(4.6)调节pH至4.5±0.2,定量转到250mL容量瓶中，用水定容，充分混合。用滤纸过滤，弃去最初的几毫升。吸取滤液5mL,加入约20mL水，用氢氧化钠溶液(4.6)调pH为6.8±0.2,定量转到100mL容量瓶中，用水定容。

6.3 标准曲线的制作

按表1顺序加入水、标准曲线工作液(4.8.4)和生物素测定用培养基(4.3.3)于培养管中，一式三份。

表1标准曲线的制作

6.4 待测液的制作

按表2顺序加水、样品溶液(6.2.3)和生物素测定用培养基(4.3.3)于培养管内，一式三份。每份样品需带样品空白试管一只，管内分别加入5mL待测液和5mL培养基。

表2 待测液的制作

6.5 灭菌

将6.3和6.4中所有的试管盖上试管帽，放入灭菌釜内，121℃灭菌5min(商品培养基按标签说明进行灭菌)。

6.6 接种

从灭菌釜内取出试管，将试管迅速冷却至30℃以下。将接种菌悬液(6.1.2)用滴管或移液器向上述试管中各滴加一滴(约50uL),其中标准曲线管中未接种空白S1和样品空白除外。

6.7 培养

将试管放入培养箱内，36℃±1℃培养19h～20h。

6.8 测定

对每支试管进行视觉检查，接种空白试管S1内培养液应是澄清的，如果出现浑浊，则结果无效。

6.8.1 以接种空白试管S1做对照，测定最高浓度标准曲线试管的吸光度，两小时后重新测定。两次结果透光率差值若小于2%,则取出全部检验管测其吸光度A。

6.8.2 以接种空白试管S2为空白，调节吸光度为0,依次读出其他每支试管的吸光度A,样品空白的吸光度A—并读出。

6.8.3 用涡旋混合器充分混合每一支试管(也可以加一滴消泡剂)后，立即将培养液移入比色皿内进行测定，波长为550nm,待读数稳定30s后，读出吸光度A,每支试管稳定时间要相同。以生物素标准品的含量为横坐标，吸光度A为纵坐标作标准曲线。

6.8.4 待测液培养试管中，样品空白试管吸光度应小于0.05。若样品空白试管吸光度大于0.02,加入待测液1mL的试管的吸光度值要减去其样品空白试管吸光度值的1/5,加入待测液2mL的试管的吸光度值要减去其样品空白试管吸光度值的2/5,以此类推，作为计算结果的依据。根据待测液的吸光度A, 从标准曲线中查得该待测液中生物素的浓度，再根据稀释因子和称样量计算出试样中生物素的含量。吸 光度值超出标准曲线管S3～S10范围的试样管要舍去。

6.8.5 对每个编号的待测液试管，用每支试管的吸光度值计算每毫升该编号待测液生物素的含量，并 计算该编号待测液的生物素含量平均值，每支试管测得的该浓度不得超过该平均值的±15%,超过者要 舍去。如果符合该要求的管数少于所有四个编号待测液总管数的2/3,需要重新检验。如果符合该要求 的管数大于等于原来管数的2/3,重新计算每一编号的有效试样管中每毫升测定液生物素含量的平均值， 以此平均值计算全部编号试样管的总平均值Cx,用于计算试样中的生物素含量。

7 分析结果的表述

试样中生物素的含量按公式(1)计算：

式中：

X—试样中生物素的含量，单位为微克每百克(ug/100g)；

C_x—6.8.5中计算所得的总平均值，单位为纳克(ng)；

m—试样的质量，单位为克(g);

f—稀释倍数。

以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留两位有效数字。

8 精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

9 其他

本标准检出限为20.0ug/g。

相关链接：婴幼儿食品和乳品中游离生物素的测定（一）

文章来源：《食品安全国家标准汇编检验方法（一）》

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