5 操作步骤

5.1 样品制备

5.1.1 样品采集后应尽快检验，若不能及时检验，可在2℃～5℃保存；如8h内不能进行检验，应以无菌操作称取25g(mL)样品加入等量缓冲甘油-氯化钠溶液(液体样品应加双料)，并尽快至于-60℃低温冰箱中冷冻保存或加干冰保存。

5.1.2 以无菌操作称取25g(mL)样品放入含有225mL 0.1%蛋白胨水(如为5.1.1中冷冻保存样品，室温解冻后，加入200mL 0.1%蛋白胨水)的均质袋中，在拍击式均质器上连续均质1min～2min；或置于盛有225mL 0.1%蛋白胨水的均质杯中，8000r/min～10000r/min均质Imin～2min,作为1:10稀释液。

5.1.3 以上述1:10稀释液按1mL加0.1%蛋白胨水9mL制备10-2～10-6的系列稀释液。

5.2 培养

5.2.1 吸取各稀释液1mL加入无菌平皿内，每个稀释度做两个平行。每个平皿倾注冷却至50℃的TSC琼脂(可放置于50℃±1℃恒温水浴箱中保温)15mL,缓慢旋转平皿，使稀释液和琼脂充分混匀。

5.2.2 上述琼脂平板凝固后，再加10mL冷却至50℃的TSC琼脂(可放置于50℃±1℃恒温水浴箱中保温)均匀覆盖平板表层。

5.2.3 待琼脂凝固后，正置于厌氧培养装置内，36℃±1℃培养20h～24h。

5.2.4 典型的产气荚膜梭菌在TSC琼脂平板上为黑色菌落。

5.3 确证试验

5.3.1 从单个平板上任选5个(小于5个全选)黑色菌落，分别接种到FTG培养基，36℃±1℃培养18h～24h。

5.3.2 用上述培养液涂片，革兰氏染色镜检并观察其纯度。产气荚膜梭菌为革兰氏阳性粗短的杆菌,有时可见芽孢体。如果培养液不纯，应划线接种TSC琼脂平板进行分纯，36℃±1℃厌氧培养20h～24h,挑取单个典型黑色菌落接种到FTG培养基，36℃±1℃培养18h～24h,用于后续的确证试验。

5.3.3 取生长旺盛的FTG培养液ImL接种于含铁牛乳培养基，在46℃±0.5℃水浴中培养2h后，每小时观察一次有无“暴烈发酵”现象，该现象的特点是乳凝结物破碎后快速形成海绵样物质，通常会上升到培养基表面。5h内不发酵者为阴性。产气荚膜梭菌发酵乳糖，凝固酪蛋白并大量产气，呈“暴烈发酵”现象，但培养基不变黑。

5.3.4 用接种环(针)取FTG培养液穿刺接种缓冲动力-硝酸盐培养基，于36℃±1℃培养24h。在透射光下检查细菌沿穿刺线的生长情况，判定有无动力。有动力的菌株沿穿刺线呈扩散生长，无动力的菌株只沿穿刺线生长。然后滴加0.5mL试剂甲和0.2mL试剂乙以检查亚硝酸盐的存在。15min内出现红色者，表明硝酸盐被还原为亚硝酸盐；如果不出现颜色变化，则加少许锌粉，放置10min,出现红色者,表明该菌株不能还原硝酸盐。产气荚膜梭菌无动力，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。

5.3.5 用接种环(针)取FTG培养液穿刺接种乳糖-明胶培养基，于36℃±1℃培养24h,观察结果。如发现产气和培养基由红变黄，表明乳糖被发酵并产酸。将试管于5℃左右放置1h,检查明胶液化情况，如果培养基是固态，于36℃±1℃再培养24h,重复检查明胶是否液化。产气荚膜梭菌能发酵乳糖，使明胶液化。

6 结果与报告

6.1 典型菌落计数

选取典型菌落数在20CFU～200CFU之间的平板，计数典型菌落数。如果：

a)只有一个稀释度平板的典型菌落数在20CFU～200CFU之间，计数该稀释度平板上的典型菌落；

b)最低稀释度平板的典型菌落数均小于20CFU,计数该稀释度平板上的典型菌落；

c)某一稀释度平板的典型菌落数均大于200CFU,但下一稀释度平板上没有典型菌落，应计数该稀释度平板上的典型菌落；d)某一稀释度平板的典型菌落数均大于200CFU,且下一稀释度平板上有典型菌落，但其平板上的典型菌落数不在20CFU～200CFU之间，应计数该稀释度平板上的典型菌落；

e)2个连续稀释度平板的典型菌落数均在20CFU～200CFU之间，分别计数2个稀释度平板上的典型菌落。

6.2 结果计算

6.1 计数结果按公式(1)计算：

式中：

T—样品中产气荚膜梭菌的菌落数；

A—单个平板上典型菌落数；

B—单个平板上经确证试验为产气荚膜梭菌的菌落数；

C—单个平板上用于确证试验的菌落数；

n1——第一稀释度(低稀释倍数)经确证试验有产气荚膜梭菌的平板个数；

n2——第二稀释度(高稀释倍数)经确证试验有产气荚膜梭菌的平板个数；

0.1——稀释系数；

d—稀释因子(第一稀释度)。

6.3 报告

根据TSC琼脂平板上产气荚膜梭菌的典型菌落数，按照6.2中公式计算，报告每g(mL)样品中产气荚膜梭菌数，报告单位以CFU/g(mL)表示；如T值为0,则以小于1乘以最低稀释倍数报告。

相关链接：食品微生物学检验产气荚膜梭菌检验（一）

文章来源：《食品安全国家标准汇编检验方法（二）》

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