1 范围

本标准规定了食品中双歧杆菌(Bifidobacterium)的鉴定方法。

本标准适用于食品中双歧杆菌的鉴定。

2 设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养没备外，其他设备和材料如下：

a)恒温培养箱：36℃±1℃；

b)气相色谱仪配FlD检测器；

c)冰箱：2℃～5℃；

d)天平：感量0.1g；

e)无菌试管：18mm×180mm、15mm×100mm；

f)无菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器(200uL～1000uL)及配套吸头；

g)无菌锥形瓶：500mL、250mL。

3 培养基和试剂

3.1 双歧杆菌培养基。

3.2 PYG液体培养基。

3.3 甲醇：分析纯。

3.4 三氯甲烷：分析纯。

3.5 硫酸：分析纯(体积比)。

3.6 冰乙酸：分析纯(体积比)。

3.7 乳酸：分析纯。

3.8 乙酸标准溶液：吸取分析纯冰乙酸5.7mL，移入100mL容量瓶中，加水至刻度，标定，此溶液浓度约为1moI/L。

3.9 乙酸标准使用液：将经标定的乙酸标准溶液用水稀释至0.01mol/L。

3.10 乳酸标准溶液：吸取分析纯乳酸8.4mL,移入100mL容量瓶中，加水至刻度，标定，此溶液浓度约为1mol/L。

3.11 乳酸标准使用液：将经标定的乳酸标准溶液用水稀释至0.01mol/L。

4 鉴定程序

双歧杆菌鉴定程序见图1。

图1双歧杆菌鉴定程序

5 操作步骤

5.1 样品制备

5.1.1 样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。

5.1.2 以无菌操作称取25g(mL)样品，置于装有225mL生理盐水的灭菌锥形瓶内，制成1:10的样品匀液。

5.2 稀释及涂布培养步骤

5.2.1 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1.0mL,沿管壁缓慢注于装有9mL生理盐水的无菌试管中(注意吸管尖端不要触及稀释液)，振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。

5.2.2 另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头，按521操作顺序，做10倍递增样品匀液，每递增稀释一次，即换用1次1mL灭菌吸管或吸头。

5.2.3 根据待鉴定菌种的活菌数，选择三个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取0.1mL稀释液，用L棒在双歧杆菌琼脂平板进行表面涂布，每个稀释度作两个平皿。置36℃±1℃温箱内培养48h±2h,培养后选取单个菌落进行纯培养。

5.3 纯培养

挑取3个或以上的菌落接种于双歧杆菌琼脂平板，厌氧，36℃±1℃培养48h。

5.4 镜检及生化鉴定

5.4.1 涂片镜检双歧杆菌菌体为革兰氏染色阳性，不抗酸、无芽孢，无动力，菌体形态多样，呈短杆状、纤细杆状或球形，可形成各种分支或分叉形态。

5.4.2 生化鉴定过氧化氢酶试验为阴性。选取纯培养平板上的三个单个菌落，分别进行生化反应检测。

5.5 有机酸代谢产物测定

气相色谱法测定双歧杆菌的有机酸代谢产物。

6 报告

根据镜检及生化鉴定的结果(5.4)、双歧杆菌的有机酸代谢产物乙酸与乳酸微摩尔之比大于1(5.5),报告双歧杆菌属的种名。

文章来源：《食品安全国家标准汇编检验方法（二）》

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