4.2 操作步骤

4.2.1 样品处理

冷冻样品应在45℃以下不超过15min或在2℃～5℃不超过18h解冻，若不能及时检验，应放于-20℃～-10℃保存；非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验，若不能及时检验，应置于2℃～5℃冰箱保存，24h内检验。

4.2.2 样品制备称取样品25g,放入盛有225mL PBS或生理盐水的无菌均质杯内，用旋转刀片式均质器以8000r/min～10000r/min均质1min～2min,或放入盛有225mLPBS或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min。若样品为液态，吸取25mL样品至盛有225mL PBS或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中，振荡混匀，作为1：10的样品匀液。

4.2.3 样品的稀释

吸取4.2.2中1：10的样品匀液1mL加到装有9mL PBS或生理盐水的稀释管中,充分混匀制成1：100的样品匀液。跟据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。

4.2.4 样品接种

根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液)，以0.3mL、0.3mL、0.4mL接种量分别移入三块MYP琼脂平板，然后用无菌L棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。使用前，如MYP琼脂平板表面有水珠，可放在25℃～50℃的培养箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。

4.2.5 分离、培养

4.2.5.1 分离

在通常情况下，涂布后，将平板静置10nin。如样液不易吸收，可将平板放在培养箱30℃±1℃培养1h,等样品匀液吸收后翻转平皿，倒置于培养箱，30℃±1℃培养24h±2h。如果菌落不典型，可继续培养24h±2h再观察。在MYP琼脂平板上，典型菌落为微粉红色(表示不发酵甘露醇)，周围有白色至淡粉红色沉淀环(表示产卵磷脂酶)。

4.2.5.2 纯培养

从每个平板(符合4.4.1.1要求的平板)中挑取至少5个典型菌落(小于5个全选)，分别划线接种于营养琼脂平板做纯培养，30℃±1℃培养24h±2h,进行确证实验。在营养琼脂平板上，典型菌落为灰白色，偶有黄绿色，不透明，表面粗糙似毛玻璃状或融蜡状，边缘常呈扩展状，直径为4mm～10mm。

4.3 确定鉴定

4.3.1 染色镜检

挑取纯培养的单个菌落，革兰氏染色镜检。蜡样芽孢杆菌为革兰氏阳性芽孢杆菌，大小为(1um～1.3um)×(3um～5um),芽胞呈椭圆形位于菌体中央或偏端，不膨大于菌体，菌体两端较平整，多呈短链或长链状排列。

4.3.2 生化鉴定

4.3.2.1 概述

挑取纯培养的单个菌落，进行过氧化氢酶试验、动力试验、硝酸盐还原试验、酪蛋白分解试验、溶菌酶耐性试验、V-P试验、葡萄糖利用(厌氧)试验、根状生长试验、溶血试验、蛋白质毒素结晶试验。蜡样芽孢杆菌生化特征与其他芽孢杆菌的区别见表1。

表1蜡样芽孢杆菌生化特征与其他芽孢杆菌的区别

相关链接：食品微生物学检验蜡样芽孢杆菌检验（一）

文章来源：《食品安全国家标准汇编检验方法（二）》

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