1 范围

本标准规定了体外哺乳类细胞DNA损伤修复(非程序性DNA合成)试验的基本试验方法和技术要求。

本标准适用于评价受试物的诱变性和(或)致癌性。

2 术语和定义

非程序性DNA合成

当DNA受损伤时，损伤修复的DNA合成主要在S期以外的其他细胞周期，称非程序性DNA合成。

3 试验目的和原理

在正常情况下,DNA合成仅在细胞有丝分裂周期的S期进行。当化学或物理因素诱发DNA损伤后，细胞启动非程序性DNA合成程序以修复损伤的DNA区域。在非S期分离培养的原代哺乳动物细胞或连续细胞系中，加入³H-胸腺嘧啶核苷(³H-TDR),通过DNA放射自显影技术或液体闪烁计数(LSC)法检测染毒细胞中³H-TDR掺入DNA的量,可说明受损DNA的修复合成的程度。

在体外培养细胞中,用缺乏半必需氨基酸精氨酸的培养基(ADM)进行同步培养,DNA合成的始动受阻,使细胞同步于Gl期;并用药物(常用羟基脲)抑制残留的半保留DNA复制后,通过3H-TDR掺入可显示非程序性DNA合成(UDS)。

4 试剂和材料

4.1 试剂

注：全部试剂除注明外，均为分析纯,试验用水为双蒸水或超纯水。.

4.1.1 细胞增殖用培养基

EagIe最低要求培养基(Eagle's Minimal Essential Medium，EMEM),加入10%小牛血清、青霉素、链霉素贮存液,使青霉素的最终浓度为100单位,链霉素的最终浓度为100μg/mL。EMEM培养基可选用各种商品供应之粉末培养基按生产厂商提供资料配制并除菌。4℃冰箱贮存。

4.1.2 细胞同步用培养基

不含精氨酸之EMEM培养基(ADM),加入小牛血清、青霉素、链霉素浓度同细胞增殖用培养基。

4.1.3 Hanks平衡盐溶液(HBSS)

4.1.3.1 贮液A：将氯化钠160g,氯化钾8g,硫酸镁(MgSO₄∙7H₂O)2g及氯化镁(MgCl₂∙6H₂O)2g溶于800mL双蒸水(50℃～60℃)中。另取无水氯化钙2.8g溶于100mL双蒸水中。将上述两溶液混合后，加水定容至1000mL,加入三氯甲烷2mL,保存于4℃冰箱中。

4.1.3.2 贮液B：将磷酸氢二钠(Na₂HPO₄∙12H₂O)3.04g(或Na₂HPO₄∙2H₂O 1.2g)、磷酸二氢钾(KH₂PO₄∙2H₂O)1.2g(或KH₂PO₄ 0.95g)、葡萄糖20g溶解于800mL双蒸水中，加入100mL 0.4%酚红溶液［取酚红1g,溶于3mL氢氧化钠(1mol/L)中］,待完全溶解后，加入双蒸水中至250mL,加水定容至1000mL,加入三氯甲烷2mL,保存于4℃冰箱中。

4.1.3.3 贮液C：1.4%碳酸氢钠以双蒸水配制。

4.1.3.4 应用液的配制：取A液1份,B液1份,水18份，混合后分装于玻璃容器内；高压灭菌，4℃冰箱保存。用前加入C液，将PH调整至7.2～7.4。

4.1.4 无钙、镁的Dulbecco氏磷酸缓冲液

pH7.4,取氯化钠8.00g、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.20g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠(Na₂HPO₄•12H₂O)2.89g溶解并定容至1000mL双蒸水中。

4.1.5 0.02%乙二肢四乙酰二钠或四钠(EDTA)溶液

取EDTA 0.2g溶于无钙、镁的磷酸缓冲液中，定容至1000mL。高压灭菌后使用。

4.1.6 抗菌素贮存液

取临床注射用青霉素G100万单位及链霉素1g粉剂，在无菌操作下溶于100mL之灭菌蒸馏水中，使青霉素的浓度为1万单位,链霉素的浓度为10000μg/mL,使用时每100mL培养基中加入抗菌素贮存液1mL。

4.1.7 大鼠肝微粒体S-9组分的制备

S-9混合液可按以下方式配制：将磷酸氢二钠(Na₂HPO₄∙12H₂O)86.8mg、磷酸二氢钾7.0mg、氯化镁(MgCl₂∙6H₂O)8.1mg,6-磷酸葡萄糖(G-6-P)5.4mg、辅酶Ⅱ(CoⅡ)(纯度90%)4mg溶于ADM中，加入N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPES)溶液(1mol/L)0.2mL及大鼠肝S-9组分0.8mL～4mL或20mL,并用碳酸氢钠溶液调整PH至7.2～7.4。

相关链接：啮齿类动物显性致死试验（二）

文章来源：《食品安全国家标准汇编检验方法（二）》

版权与免责声明：转载目的在于传递更多信息。

如其他媒体、网站或个人从本网下载使用，必须保留本网注明的"稿件来源"，并自负版权等法律责任。

如涉及作品内容、版权等问题，请在作品发表之日起两周内与本网联系，否则视为放弃相关权利。