4.1.8 显影液及定影液(放射自显影用)

4.1.8.1 Kodak D-170显影液

贮液:无水亚硫酸钠25g、溴化钾1g,水加至200mL。使用时用水稀释，溶入2-氨基酚盐酸盐(Amitol)4.5g,定容至1000mL。

4.1.8.2 Kodak D-196显影液

水(50℃)500mL,顺次溶入米吐尔(硫酸对甲氨基苯酚)2g,无水亚硫酸钠72g,对苯二酚8.8g,无水碳酸钠48g,溴化钾4g,定容至1000mL。

4.1.8.3 停显液

98%冰乙酸15mL,定容至1000mL。

4.1.8.4 Kodak F-5定影液

水(50℃)100mL,依次溶入海波240g,无水亚硫酸钠15g,28%乙酸48mL,硼酸7.5g,钾钒15g,定容至1000mL。

4.1.9 高氯酸(0.25mol/L及0.5mol/L)

70%高氯酸8.57mL,加水至100mL,浓度为1mol/L。

4.1.10 闪烁液

称取2,5-二苯基恶唑(PPO)5g、1,4-双-[5-苯基恶唑基-2]-苯(POPOP)300mg溶于甲苯中，定容至1000mL。

4.2 材料

推荐使用一次性细胞培养用器皿及微孔滤膜,普通试验器材使用前应按细胞培养技术要求清洗、包扎、消毒灭菌。对不带橡皮塞的玻具及金属用具可用高温灭菌,温度升至140℃后,保持2h。橡皮类及带橡皮塞之玻具应用高压灭菌120℃,30min。溶液除不耐热的应用抽滤除菌外，耐热的可用高压灭菌，一般用115℃，10min。

5 试验方法

5.1 受试物

受试物在试验时新鲜配制。先将受试物溶于适当溶媒(蒸馏水、二甲亚砜、丙酮等)中，配制成所需浓度,试验时加于培养基中，使溶媒的最终浓度为1%,不影响细胞活性：

5.2 对照

每次试验均应同时设置加和不加代谢活化系统两种情况下的阳性和阴性(溶媒)对照。

用大鼠肝细胞进行试验时，阳性对照物可用7,12-二甲基苯并蒽(7,12-DMBA,7,12-dimethyl-benzathracene)和2-乙酰氨基芴(2-AAF,2-acetylaminofluorene),如果用细胞系，在无代谢活化系统情况下，放射自显影和LSC检测均可用4-硝基喹啉氧化物(4-NQO,4-nitroquinoline oxide)作为阳性对照物；而在有代谢活化系统情况下，则用N-二甲基亚硝胺(N-ClimethyInitrosamine)作为阳性对照物。

5.3 染毒浓度

受试物最高染毒浓度的选择由预试验获得。选用多个浓度受试物进行预试验,浓度应覆盖确定毒性反应的合适范围。受试物最高染毒浓度应产生一定细胞毒性。相对不溶于水的受试物应以其能达到的最高溶解度进行试验。对于易溶于水的受试物,应根据受试物细胞存活率的范围值确定染毒浓度。

5.4 代谢活化

除非采用肝原代细胞,建株细胞中药物代谢活化酶系的活性一般都很低，因此对一些需经酶代谢活化才显示其DNA损伤作用的化学物质，可在试验体系中加入以大鼠肝微粒体酶系及辅助因子组成的体外活化系统(S-9混合液)，

5.5 细胞培养

5.5.1 细胞的选择

原代培养细胞(如大鼠肝细胞)，人淋巴细胞或已建系的细胞(如人羊膜细胞FL株、人二倍体成纤维细胞、HeIa细胞)都可用于本试验。人类细胞的UDS反应大于啮齿类动物细胞。使用最多的人类细胞为成纤维细胞、外周血淋巴细胞、单核细胞和Hela细胞等。

5.5.2 培养条件

选用适当的生长培养基、CO₂浓度、温度和湿度维持细胞生长。细胞系应定期检查有无支原体污染。

5.5.3 细胞的传代、维持和贮存

生长成单层的细胞，除去培养基。用Hanks平衡盐液(HBSS)洗涤后，用0.02% EDTA或0.1%胰酶溶液(于无Ca²⁺、Mg²⁺之磷酸盐缓冲液中)于37℃下处理数分钟使细胞退缩，细胞间隙增加。再用HBSS洗涤1次,加入适量培养基,反复吹吸，使细胞自玻面上脱下并分散于培养基中。取细胞悬液一滴,加于血球计数池中，计数4大格中的细胞数,计算出悬液中之细胞浓度(4大格的细胞数/4×10⁴即为每毫升所含细胞数)。将细胞悬液生长培养基稀释至0.5×10⁵个/mL～1×10⁵个/mL。将上述细胞悬液接种于培养瓶中(30mL培养瓶可接种3mL。100mL的培养瓶可接种10mL)。每次接种3份，长成融合单层后取其中一瓶再按以上方法传代接种3瓶。另两瓶在证明传代成功后弃去或供试验所用，这样可保证细胞在试验中延续保持。有条件可按下法将细胞贮存于液氮中。若较长时间不用，不必在实验室中维持。在需要时取出经增殖后供试验所用。将细胞增殖至所需数量后,按上法制成细胞悬液(于生长用培养基中)。细胞浓度为1×10⁶个/mL～1.5×10⁶个/mL。在冰浴中，逐渐加入为细胞悬液总量10%的灭菌二甲基亚砜。然后将细胞悬液分装于洁净干燥之灭菌的玻璃容器或细胞冻存专用塑料小管中，每份1mL。封口后，置于4℃中2h～3h,然后移至普通冰箱之冰室内4h～5h,再移入-30℃～-20℃之低温冰箱内过夜。次日晨将安瓿移入生物用液氮储存器内。需用时,将安瓿或小塑料管锯(打)开，除去含有二甲基亚砜的培养基,加入适量之生长用培养基,并调整细胞浓度至10×10⁴个/mL～15×10⁴个/mL。分种于细胞培养瓶中，37℃培养1h后,换培养基一次,将无活力之细胞除去,待长成融合单层后分传增殖维持于实验室中。

文章来源：《食品安全国家标准汇编检验方法（二）》

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