5.3 处理

取生长良好的细胞,调整密度为5×10⁵/mL,按1%体积加入受试物(需代谢活化的情况下，同时加入终浓度为1%～10%的S9混合物)，37℃振摇处理3h(L5178Y细胞)或4h(TK6细胞)，以800r/min～1000r/min的速度离心4min～6min,弃上清液，用PBS或不含血清的培养基洗涤细胞2遍，重新悬浮细胞于含10%马血清的RPMI 1640培养液中，并调整细胞密度为2×10⁵/mL。

5.4 PE₀ (0d的平板接种效率)测定

取适量细胞悬液,作梯度稀释至8个细胞/mL,接种96孔板(每孔加0.2mL,即平均1.6个细胞/孔)，每个剂量种1块～2块平板,37℃,5%二氧化碳,饱和湿度条件下培养12d,计数每块平板有集落生长的孔数。

5.5 表达

取5.3所得细胞悬液,作2d(L5178Y细胞)或3d(TK6细胞)表达培养，每天计数细胞密度并保持密度在10⁶/mL以下,计算相对悬浮生长(RSG)。

5.6 PE₂(L5178Y细胞)或PE₃(TK6细胞)测定

表达培养结束后,取适量细胞悬液,按5.4方法测定PE₂/PE₃。

5.7 突变频率(MF)测定

5.7.1 L5178Y细胞

L5178Y细胞表达培养2d后,取适量细胞悬液,调整细胞密度为1×10⁴/mL,加入TFT(终浓度为3ug/mL),混匀，接种96孔板(每孔加0.2mL,即平均2000个细胞/孔)，每个剂量作2块～4块板，37℃,5%二氧化碳，饱和漫度条件下培养12d,计数有突变集落生长的孔数。突变集落按大集落(Large colony,LC:直径≥1/4孔径，密度低)和小集落(Small colony,SC:直径＜1/4孔径，密度高)分别计数。极小集落可再继续培养3d后计数。

5.7.2 TK6细胞

TK6细胞表达培养3d后，取适量细胞悬液，调整细胞密度至1.5×10⁵/mL,加入TFT(终浓度为3ug/mL),混匀，接种96孔板(每孔加0.2mL,即平均30000个细胞/孔)，每个剂量作2块～4块板,37℃,5%二氧化碳，饱和湿度条件下培养12d,计数正常生长突变集落(normal-growth colony,NC)。然后每孔再追加适量TFT,继续培,养12d,计数新长成的缓慢生长突变集落(Slow-growth colony,SC)。

6 数据处理与结果评价

6.1 数据处理

6.1.1 平板效率(PE₀、PE₂/PE₃)

平板效率(％)的计算见式(1)：

式中：

EW—无集落生长的孔数；

TW—总孔数；

1.6—每孔接种细胞数。

6.1.2 相对存活率(RS)

相对存活率(％)的计算见式(2)：

注：溶媒使用非水溶媒时，与溶媒对照比较。

6.1.3 相对悬浮生长(RSG)

相对悬浮生长(％)的计算见式(3):

注：溶媒使用非水溶媒时，与溶媒对照比较。

6.1.4 相对总生长(relativetotalgrowth,RTG)

相对总生长(％)的计算见式(4):

RTG=RSG×RSn×100%-----------------(4)

式中：

RSn—第2天(L5178Y细胞)或第3天(TK6细胞)的相对存活率。

文章来源：《食品安全国家标准汇编检验方法（二）》

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