5.4 试验期限

5.4.1 试验期限小鼠为18个月，大鼠为24个月，个别生命期较长和自发性肿瘤率较低的动物可适当延长。

5.4.2 试验期间，当最低剂量组或对照组存活的动物数仅为开始时的25%时(雌、雄性动物分别计算),可及时终止试验。高剂量组动物因明显的受试物毒性作用出现早期死亡,不应终止试验。

5.5 试验步骤和观察指标

5.5.1 受试物给予

5.5.1.1 根据受试物的特性和试验目的,选择受试物掺入饲料、饮水或灌胃方式给予。若受试物影响动物适口性,应灌胃给予。

5.5.1.2 受试物灌胃给予,要将受试物溶解或悬浮于合适的溶媒中，首选溶媒为水。不溶于水的受试物可使用植物油(如橄榄油、玉米油等)，不溶于水或油的受试物可使用羧甲基纤维素、淀粉等配成混悬液或糊状物等。受试物应现用现配,有资料表明其溶液或混悬液储存稳定者除外。同时应考虑使用的溶媒可能对受试物被机体吸收、分布、代谢和蓄积的影响；对受试物理化性质的影响及由此而引起的毒性特征的影响;对动物摄食量或饮水量或营养状况的影响。为保证受试物在动物体内浓度的稳定性,每日同一时段灌胃1次(每周灌胃6d),试验期间，前4周每周称体重2次，第5周～第13周每周称体重1次,之后每4周称体重1次,按体重调整灌胃体积。灌胃体积一般不超过10mL/kg体重；如为油性液体,灌胃体积应不超过4mL/kg体重。各组灌胃体积一致。

5.5.1.3 受试物掺入饲料或饮水给予,要将受试物与饲料(或饮水)充分混匀并保证该受试物配制的稳定性和均一性，以不影响动物摄食、营养平衡和饮水量为原则。饲料中加入受试物的量很少时，宜先将受试物加入少量饲料中充分混匀后,再加入一定量饲料后再混匀，如此反复3次～4次。受试物掺入饲料比例一般小于质量分数5%,若超过5%时(最大不应超过10%),可调整对照组饲料营养素水平(若受试物无热量或营养成分,且添加比例大于5%时,对照组饲料应填充甲基纤维素等,掺入量等同高剂量)，使其与受试物各剂量组饲料营养素水平保持一致，同时增设未处理对照组；亦可视受试物热量或营养成分的状况调整剂量组饲料营养素水平,使其与对照组饲料营养素水平保持一致。受试物剂量单位是每千克体重所摄入受试物的毫克(或克)数，即mg/kg体重(或g/kg体重)，当受试物掺入饲料,其剂量单位亦可表示为mg∕kg(或g/kg)饲料,掺入饮水则表示为mg/mL水。受试物掺人饲料时,需将受试物剂量(mg/kg体重)按动物每100g体重的摄食量折算为受试物饲料浓度(mg/kg饲料)。

5.5.2 一般观察

5.5.2.1 试验期间至少每天观察1次动物的一般临床表现,并记录动物出现中毒的体征、程度和持续时间及死亡情况。

5.5.2.2 应特别注意肿瘤的发生,记录肿瘤发生时间、发生部位、大小、形状和发展等情况。

5.5.2.3 对濒死和死亡动物应及时解剖并尽量准确记录死亡时间。

5.5.3 体重、摄食量及饮水量

试验期间前13周每周记录动物体重、摄食量或饮水量(当受试物经饮水给予时)，之后每4周1次。试验结束时,计算动物体重增长量、总摄食量、食物利用率(前3个月)、受试物总摄入量。

5.5.4 眼部检查

试验前,对动物进行眼部检查(角膜、球结膜、虹膜).试验结束时,对高剂量组和对照组动物进行眼部检查,若发现高剂量组动物有眼部变化,则应对其他组动物进行检查。

5.5.5 血液学检查

5.5.5.1 试验第3个月、第6个月和第12个月进行血液学检查，必要时，试验第18个月和试验结束时也可进行，每组至少检查雌雄各10只动物，每次检查应尽可能使用同一动物。如果90天经口毒性试验的剂量水平相当且未见任何血液学指标改变,则试验第3个月可不检查。

5.5.5.2 检查指标为白细胞计数及分类(至少三分类)、红细胞计数、血小板计数、血红蛋白浓度、红细胞压积、红细胞平均容积(MCV)、红细胞平均血红蛋白量(MCH)、红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)、凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT )等。如果对造血系统有影响，应加测网织红细胞计数和骨髓涂片细胞学检査。

5.5.6 血生化检查

5.5.6.1 按5.5.5.1规定的时间和动物数进行。如果90天经口毒性试验的剂量水平相当且未见任何血生化指标改变,则试验第3个月可不检查。采血前宜将动物禁食过夜。

5.5.6.2 检查指标包括电解质平衡、糖、脂和蛋白质代谢、肝(细胞、胆管)肾功能等方面。至少包含谷氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、谷氨酰转肽酶(GGT)、尿素(Urea)、肌SF(Cr)、血糖(Glu)、总蛋白(TP)、白蛋白(Alb)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、钙、氯、钾、钠、总胆红素等,必要时可检测磷、尿酸(UA)、总胆汁酸(TBA)、球蛋白、胆碱酯酶、山梨醇脱氢酶、高铁血红蛋白、特定激素等指标。

5.5.7 尿液检查

5.5.7.1 试验第3个月、第6个月和第12个月进行尿液检查，必要时,试验第18个月及试验结束时也可进行，每组至少检查雌雄各10只动物。如果90天经口毒性试验的剂量水平相当且未见任何尿液检查结果异常,则试验第3个月可不检查。

5.5.7.2 检查项目包括外观、尿蛋白、相对密度、pH、葡萄糖和潜血等，若预期有毒反应指征，应增加尿液检查的有关项目如尿沉渣镜检、细胞分析等。

文章来源：《食品安全国家标准汇编检验方法（二）》

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