四、薄层色谱法的一般流程

(一) 样品的预处理

一般认为薄层色谱所用固定相(薄层板)可即用即弃，不怕供试液中杂质的污染，因而样品无需净化精制。但在实践中，由于中药的成分复杂，未知成分多，供试液中溶出的物质较多，其中既有待测成分也有其他“杂质”。常常由于相互干扰或背景污染而难以得到满意的分离效果，甚至难以辨认，成方制剂更是如此。所以，许多情况下为了得到一个较为清晰的色谱，样品提取物经预处理，使供试液得以净化，往往是一个重要的有时甚至是关键的步骤。供试液净化的方法通常有：单一溶剂萃取法、分段萃取法、液液萃取法、固相萃取法等，可根据鉴别成分的性质以及样品的性质采用。

(二) 薄层板的制备

1. 市售薄层板临用前一般应在110℃活化30分钟；聚酰胺薄膜不需活化；铝基片薄层板、塑料薄层板可根据需要剪裁，但须注意剪裁后的薄层板底边的固定相层不得有破损。如在存放期间被空气中杂质污染，使用前可用三氯甲烷、甲醇或二者的混合溶剂在展开缸中上行展开预洗，晾干，110℃活化，置干燥器中备用。

2. 自制薄层板除另有规定外，将1份固定相和3份水(或加有黏合剂的水溶液，如0.2%～0.5%羟甲基纤维素钠水溶液，或为规定浓度的改性剂溶液)在研钵中按同一方向研磨混合，去除表面的气泡后，倒入涂布器中，在玻板上平稳地移动涂布器进行涂布(厚度为0.2～0.3mm)，取下涂好薄层的玻板，置水平台上于室温下晾干后，在110℃烘30分钟，随即置于有干燥剂的干燥箱中备用。使用前检查其均匀度，在反射光及透视光下检视，表面应均匀、平整、光滑，并且无麻点、无气泡、无破损及污染。

(三) 点样

1. 点样方法可分为手动和自动点样。除另有规定外，在洁净干燥的环境中，用专用毛细管或配合相应的半自动、自动点样器械点样于薄层板上。一般为圆点状或窄细的条带状，点样基线距底边10～15mm，高效板一般基线离底边8～10mm。

(1) 手动点样：手动点样主要使用的器具有微升毛细管、微量注射器或配合与之相应的手动点样工具。

(2) 自动点样：自动点样采用半自动点样仪或全自动点样仪，按预设程序自动点样。以点样方式的不同可分为接触式点样和喷雾点样(图7-1，图7-2)。

图7-1半自动点样仪

图7-2全自动点样仪

1) 接触式点样：有样品溶液的毛细管或针头与薄层板表面接触，从而使样品在薄层板上形成圆点状的点。多采用定量毛细管、微量注射器手动点样，有的仪器也可进行自动接触式点样。接触式点样应注意：正确选择溶解样品的溶剂；原点直径一般以3mm为宜；防止点样毛细管损伤薄层表面等。

2) 喷雾点样：点样针针杆匀速缓慢下推，针头部形成的小液滴被喷头喷出的气流吹落到薄层板上，机械控制薄层板匀速摆动，则形成均匀的条带状原点。必须采用仪器进行。

喷雾点样的优点：①点样过程中，点样器不与薄层板接触，防止薄层板物理损伤。②减少点样条斑的横向及纵向扩散，样品条斑窄，展开后分离度提高。③自动化程度高，可克服人为因素，可提高点样的准确度与重现性。

2. 点样应注意的问题

(1) 对点样质量产生的影响：由于样品的溶解度以及溶液黏度等均会对点样质量产生影响，应注意选择适宜的溶剂。高效薄层板载样量较

普通薄层板小，容易引起过载，应适当调整点样量。

(2) 对点样的要求：圆点状直径一般不大于4mm，高效板一般不大于2mm。接触点样时注意勿损伤薄层表面。条带状宽度一般为5～10mm，高效板条带状宽度一般为4～8mm，可用专用半自动或自动点样器械喷雾法点样。点间距离可视斑点扩散情况以相邻斑点互不干扰为宜，一般不少于8mm，高效板供试品间隔不少于5mm。

图7-3普通薄层板点样位置示意图

(四) 展开

将点好供试的薄层板放入展开缸中，浸入展开剂的深度为距原点5mm为宜，密闭。展开剂依靠毛细作用，沿一定方向运行，使样品在固定相与流动相相互作用下得到分离。除另有规定外，一般上行展开8～15cm，高效薄层板上行展开5～8cm。在溶剂前沿达到预定展距后，取出薄层板，晾干，待检测。

边缘效应是薄层展开过程中，位于薄层板边缘的样品斑点比移值大于中间斑点的比移值，使薄层板上同一平行位置上的斑点呈弧形分布的现象。边缘效应会使斑点扩散变形，从而影响样品定性结果的判断。薄层扫描定量时，斑点的形状直接影响到扫描后的峰高和峰-宽，从而影响定量结果的准确性。预饱和是减少边缘效应的有效办法。预饱和是在展开前使展开缸达到溶剂蒸气饱和的状态，可在展开缸的内壁贴与展开缸高、宽同样大小的滤纸，一端浸入展开剂中，密闭一定时间，使溶剂蒸气达到饱和再如法展开；或在一侧槽内加入展开剂，薄层板置另一侧槽内，密闭容器，放置15～30min，再迅速将薄层板放入装有展开剂的槽内，密闭，展开(图7-4)。

图7-4 薄层板在层析缸饱和展开位置示意图

薄层展开方式主要有上行展开、下行展开、双向展开、水平展开、环形展开等。目前国内多采用上行展开。使用薄层自动展开仪，可将薄层板按预定程序单次或多次展开，提高薄层展开的重现性。

(五) 显色与检视

有颜色的物质可在可见光下直接检视，无色物质可用喷雾法或浸渍法以适宜的显色剂显色或加热显色，在可见光下检视。有荧光的物质或显色后可激发产生荧光的物质可在紫外光灯(254nm或365nm)下观察荧光斑点。对于在紫外光下有吸收的成分，可用带有荧光剂的薄层板(如硅胶GF₂₅₄板)，在紫外光灯(254nm)下观察荧光板面上的荧光物质淬灭形成的斑点：

(六) 记录

薄层色谱图像一般可采用摄像设备拍摄，以光学照片或电子图像的形式保存。也可用薄层色谱扫描仪扫描记录相应的色谱图。

在紫外光下拍摄时，光源发出的紫外光会干扰摄像设备感光，导致拍摄结果与肉眼观察存在一定的色差，应使用适当滤光片滤除紫外光。可见光下进行检视的薄层板也可采用电脑扫描仪记录薄层色谱结果。检视和图像的记录设备由暗箱及摄像设备组成：

暗箱：配备可见光、254nm和365nm紫外光光源以及相应的滤光片。

摄像设备：有胶片照相机、摄像头以及数码相机等。其中数码相机以低廉的价格、清晰的成像，以及便利的计算机接口等优点已经成为应用的主流(图7-5)。

图7-5 CAMAGReporstar3薄层照相系统

相关链接：薄层色谱法及其在药品检验中的应用（一）

文章来源：《食品安全国家标准汇编食品添加剂(五)》

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