【实验器材】

(1)仪器电子天平、高压蒸汽灭菌锅、烧杯、磁力搅拌器、容量瓶、盐水瓶、灭菌过滤器、移液器及配套枪头等。

(2)材料DMEM干粉、滤纸、称量纸、滤膜。

(3)试剂NaOH、NaHCO3、HCl、羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、新鲜制备的三蒸水、青霉素、链霉素或庆大霉素等。

【操作方法与步骤】

(一)DMEM培养液的配制

1．不完全DMEM培养液的配制

(1)溶解培养基将DMEM干粉培养基溶于800mL左右的三蒸水中，再用水洗包装袋内面2～3次，倒入培养液中。磁力搅拌或超声助溶，一般不要加热助溶。

(2)补加试剂根据包装袋说明和试验需要加入所需量的NaHCO3、L一谷氨酰胺、HEPES等其他试剂，快速旋转摇动充分溶解。

(3)调pH补加试剂充分溶解后，根据实际情况用1mol／LHCl或1mol／LNaOH调节pH至7．2～7．4，加水定容到1000mL。

(4)灭菌分装在超净台内按照好灭菌过滤器，过滤除菌。培养基边过滤边分装于小瓶(250mL或500mL)中，瓶口用胶塞塞紧。

(5)储存用塑料膜将瓶口封好，加皮筋扎紧，4℃或-20℃储存备用。

2．完全DMEM培养液的配制

(1)加小牛血清根据不完全DMEM培养液配制的量将小牛血清分装，冷冻保存(一20℃)。临用前加入小牛血清(10％～20％)。

(2)加抗生素一般抗生素终浓度为青霉素100U／mL，链霉素100U／mL。市售青霉素为80×104U／瓶，可溶于4mL体积，每升培养液中加0．5mL即可。市售链霉素为100×104U／瓶，可溶于5mL体积，每升培养液中加0．5mL即可。无链霉素的情况下，用庆大霉素代替，终浓度调为50～200U／mL。

如配制100mL的完全培养基，则需不完全DMEM培养基90mL、小牛血清10mL、青霉素100U／mL、链霉素100U／mL。

(二)RPMI一1640培养液的配制

1．不完全RPMI一1640培养液的配制

(1)溶解培养基将RPMI一1640干粉培养基溶于800mL左右的三蒸水中，再用水洗包装袋内面2～3次，倒入培养液中。磁力搅拌或超声助溶，一般不要加热助溶。

(2)补加试剂RPMI一1640干粉培养基充分溶解后，根据包装袋说明和试验需要加入2．20g NaHCO3、0．29gL一谷氨酰胺、0．1g丙酮酸钠、2．39g HEPES等其他试剂，快速旋转摇动充分溶解。

(3)调pH补加试剂充分溶解后，根据实际情况用1mol／L HCl或1mol／LNaOH调节pH至7．1，加水定容到1000mL。

(4)灭菌分装同DMEM培养液。

(5)储存同DMEM培养液。

2．完全RPMI1640培养液的配制

(1)加小牛血清同DMEM培养液。

(2)加抗生素同DMEM培养液。

(三)配制合成培养基注意事项

(1)用3d内制备的三蒸水配制培养液。

(2)按2周用量配制为宜，配量过多，存放时间过长会造成培养基老化、变质、产生沉淀。

(3)培养液中各成分是否完全溶解的判断方法：将培养液置室温或4℃冰箱30min后，观察瓶底有无颗粒产生。

(4)根据实验需要，在培养液中加入适量37℃单独溶解的NaHCO3溶液。正常体细胞培养液中Na2CO3量为2．0～2．2g／L，肿瘤细胞为1．5～1．7g／L。

(5)干粉培养基不易溶于水，若用CO2加压滤过或CO2冲击助溶方法，因CO2用量不易掌握，常出现CO2用量过多使营养液pH明显降低的情况，若再用NaHCO3调节pH时，因NaHCO3的用量也难以掌握，常造成Na+浓度过高，从而影响细胞的生长繁殖。可采用空气CO2助溶法，即将第(1)步溶液在磁场上搅拌3～4h，当其pH下降到5．8左右时(橙黄色)，氨基酸和维生素基本溶解，再加入NaHCO3等其他物品，此时营养液pH为7．0～7．1。过滤后pH上升0．1。此法操作简便，营养液pH稳定。

(6)每次安装滤器时，要将滤器上的螺帽重新拧紧，防止过滤时液体从侧面流出，因每次高压灭菌后，螺帽会松动。

(7)过滤前先用100mL左右的三蒸水过滤以湿润滤膜，过滤后要检查滤膜是否完好无损，如滤膜损坏须重新过滤。

(8)若培养液保存时间过长，L-谷氨酰胺可在临用前配制，过滤除菌后按需要量加入。