一、目的和要求

(1) 了解水细菌学检验的卫生学意义和基本原理，掌握水中细菌总数的检验方法。

(2）了解平板菌落计数原则。

二、原理

水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求各不相同，无法找到一种在某种条件下使水中所有细菌均能生长繁殖的培养基。因此，通常选择一种大部分细菌能生长的培养基，通过生长出来的菌落大致计算水中细菌总数。目前一般是采用普通肉膏蛋白陈琼脂培养基。

三、仪器与试剂

(1)高压蒸汽灭菌器。

(2）显微镜。

(3）灭菌水。

(4）肉膏蛋白陈琼脂培养基。

蛋白陈                           l0g

牛肉膏                            3g

氯化钠                            5g

琼脂                            15-20g

蒸馏水                         1000m

将上列成分混合后，加热溶解，调整pH为7.4-7.6，过滤，分装于玻璃容器中，经121℃ (151b①/in²）高压蒸汽灭菌20min，冷暗处备用。

四、实验步骤

1．水样的稀释

根据水被污染程度的不同，可用无菌吸管做10倍系列稀释。

①11b=0. 453 592掩，下同。

2．接种

以无菌操作方法用灭菌吸管吸取1mL充分混匀的水样，注入灭菌平皿中，再倾注约15mL已融化并冷却到45℃左有的培养基，并立即转动平皿，使水样与培养基充分混匀。每个水样应倾注3个平皿。每次检验时另用3个平皿只倾注营养琼脂培养基作为空白对照。

3．培养

待冷却凝固后，翻转平皿，使皿底向上，置于37℃恒温箱内培养24h，进行菌落计数。3个平皿中的平均菌落数即为水样1mL中的细菌总数。

4．菌落计数

做平皿菌落计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平皿的菌落数后，应求出同稀释度的平均菌落数，供下一步计算时应用。在求同稀释度的平均数时，若其中一个平皿有较大状菌落生长时，则不宜采用；而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的平均菌落数；若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半皿计数后乘2以代表全皿菌落数，然后再求该稀释度的平均菌落数。

五、数据处理

1．按各种不同情况进行计算

(1) 首先选择平均菌落数在30-300者进行计算，当有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则即以该平均菌落数乘其稀释倍数报告。

(2) 若有两个稀释度，其平均菌落数均为30-300，则应按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2，应报告两者的平均数；若大于2，则报告其中较小的菌落总数。

(3）若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告

(4）若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告。

(5)若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300，则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告。

2．菌落计数的报告

菌落数在100以内时按实有数报告。大于100时，采用2位有效数字，在2位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算，为了缩短数字后面的零数，也可用10的指数来表示，报告菌落数为“无法计数”时，应注明水样的稀释倍数。

六、注意事项

(1）严格无菌操作，防止污染。

(2）根据水样污染程度选择稀释倍数，必要时做预实验。