一、目的和要求

(1)了解大肠菌群测定的卫生学意义以及在饮用水中的重要性。

(2）掌握检验大肠菌群数量的多管发酵法和滤膜法。

二、原理

水体受人畜粪便、生活污水或工农业废水污染后，病原菌也随之增加。大肠菌群（coliform group）是应用最为广泛的病原菌的指示菌。

大肠菌群是肠道中的一种病原菌，随粪便污染水体。大肠菌群是一群需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽抱杆菌，在37℃生长时能使乳糖发酵，在24h内产酸产气。大肠菌群指每升水中所含有的大肠菌群的数目。我国饮用水水源水质要求总大肠菌群：一级簇1000个／L；二级簇10000个／L，我国生活饮用水卫生标准为100mL水样中总大肠菌群数不得检出，其检验方法有多管发酵法（most probablenumber, MPN）和滤膜（MF）法。

多管发酵法是根据大肠菌群所具有的特性，利用含乳糖的培养基不同稀释度的水样，经初发酵、平板分离和复发酵三个检验步骤，最后根据发酵管数查大肠菌群检数表，得出水样中的总大肠菌群数。实际上它是根据统计学理论，估计水体中大肠杆菌密度和卫生质量的一种方法。如果从理论上考虑，并且进行大量的重复检定，可以发现这种估计有大于实际数字的倾向。不过只要每一稀释试管重复数目增加，这种差异便会减少，对于细菌含量的估计值，大部分取决于那些既显示阳性又显示阴性的稀释度。因此在实验中，水样检验要求重复的数目，要根据要求数据的准确度而定。

滤膜法是将水样注入已灭菌的放有滤膜的滤器中，抽滤截取细菌，然后将滤膜贴于品红亚硫酸钠培养基上进行培养，鉴定并计数滤膜上生长的典型菌落，计算出每升水样中含有的总大肠菌群数。

粪大肠菌群是总大肠菌群的一部分，主要来自粪便。在44.5℃下能生长并发酵乳糖产酸产气的大肠菌群称为粪大肠菌群。用提高温度的方法，造成不利于来自自然环境的大肠菌群生长的条件，使培养出来的菌主要为来自粪便的大肠菌群，从而更准确地反映水质受粪便污染的情况。

三、仪器与试剂

(1) 高压蒸汽灭菌器。

(2）显微镜。

(3) 500mL滤器及0. 45μm滤膜。

(4）单倍乳糖蛋白陈培养液。

蛋白陈                                                                     l0g

牛肉浸膏                                                                   3g

乳糖                                                                         5g

NaCl                                                                         5g

1.6%溴甲酚紫[brom(o)cresol purple]乙醇溶液               1mL

蒸馏水                                                                    1000mL

调pH至7.2，分装于置有小玻璃倒管的试管中，每管l0mL,115℃高压蒸汽灭菌20min。

(5) 三倍乳糖蛋白陈培养液。

按上述配方比例3倍（除蒸馏水外），配成3倍浓缩的乳糖蛋白陈培养液，制法同上。

(6) 伊红美蓝培养基。

蛋白陈                                                                l0g

乳糖                                                                   l0g

K2HPO4                                                              2g

琼脂                                                                   20g

蒸馏水                                                              1000g

2％伊红（曙红，eosin）水溶液                                20mL

0.5％美蓝（亚甲蓝，methylene blue）水溶液             13mL

除伊红和美蓝外，其余成分混匀溶解，115℃高压蒸汽灭菌20min。灭菌后，再加入已分别灭菌的伊红液及美蓝液，充分混匀，注意勿使产生气泡。混合好的培养基应稍冷（50℃左右）再倒皿，太热会产生过多的凝集水。平皿倒置储于冰箱备用。

(7) 品红亚硫酸钠培养基（远藤氏培养基）。

蛋白陈                                  l0g

牛肉浸膏                                5g

酵母浸膏                                5g

乳糖                                     l0g

琼脂                                    20g

K2HPO4                              3. 5g

无水亚硫酸钠                           -5g

5％碱性品红乙醇溶液                 20mL

蒸馏水                                  1000mL

除无水亚硫酸钠及碱性品红乙醇溶液外，其余成分混匀溶解，调pH至7.2-7.4，115℃高压蒸汽灭菌20min。

用灭菌吸管吸取5％碱性品红乙醇溶液置于灭菌试管中，将无水亚硫酸钠置于另一支灭菌试管中，加入少许无菌水使其溶解，沸水浴中煮沸10min以灭菌。将已灭菌的亚硫酸钠液滴加于碱性品红液中，至褪成粉红色为止，再将此混合液全部加入储备基内，充分混匀，倒皿。此平板倒置储于冰箱内，如颜色由淡红变为深红，则不能再用。

四、实验步骤

1．多管发酵法

1) 水样接种量

将水样充分混匀后，根据水样污染程度确定水样接种量。每个样品至少用3个不同的接种水样量。同一接种水样量要有5支管。

相对未受污染的水样接种量为l0mL、1mL、0. 1mL。受污染水样接种量根据污染程度接种1mL、0. 1mL、0. 0lmL或0. 1 mL、0. 0l mL、0. 001 mL等。使用的水样量可参考表4-39-1。

如接种量为10mL，则试管内应装有3倍浓度乳糖蛋白陈培养液5mL；如接种量为1mL或少于1mL，则可接种于单倍浓度的乳糖蛋白陈培养液l0mL中。

2) 初发酵实验

(1）以无菌操作于5支3倍浓度的乳糖发酵管中各加入待测水样10mL，于5支单倍浓度乳糖发酵管中各加入水样1mL，另5支单倍浓度乳糖发酵管中加入按1：10稀释的水样各1mL(相当于原水样0. 1mL)，此即15管法，其接种水样总量为55. 5mL。各管经混匀后置37℃恒温箱中培养24h。

(2）若水样污染严重，如未经处理的医院污水等，其接种量可为上述的1/10（分别接种1mL、0. 1mL、0. 0lmL三个梯度）或继续10倍稀释下去，此时糖发酵管可全部用单倍浓度乳糖管。

3) 平板分离

培养24h后，发酵管颜色变黄为产酸，小玻璃倒管内有气泡为产气。将产酸产气及只产酸的发酵管用接种环划线接种于伊红美蓝培养基上，37℃培养18.24h,挑选深紫黑色有金属光泽、紫黑色不带或略带金属光泽的菌落或淡紫红色、中心色较深的菌落，将其一部分进行涂片革兰氏染色观察。

4) 复发酵实验

如上述菌落经涂片、染色、镜检后证实为革兰氏阴性无芽抱杆菌，则将菌落的另一部分接种于置有小玻璃倒管的单倍浓度乳糖发酵管中，每管可接种分离自同一发酵管的典型菌落1-3个。37℃培养24h，产酸、产气者表明该管有大肠杆菌群菌存在。

2. 滤膜法

(1) 水样滤膜处理。

① 安装滤器：将已灭菌的滤器装在接液瓶上，用橡皮管将接液瓶、缓冲瓶和真空泵相连，也可用其他方法减压，如水管龙头。

② 放置滤膜：用灭菌镊子取经高压蒸汽灭菌的滤膜一张，使其“毛”面向上平放在滤器隔膜板之上。再在膜上放一“O”形橡皮圈，使滤器漏斗与底座旋紧密闭性更好，以避免漏水。

③ 加水样。如检测水样量少于l0mL，应先加少量无菌水，以使细菌在滤膜上分布均匀。

④ 水样过滤：接通电源开始抽吸，至滤膜水全部滤过而又不使滤膜过于干燥为止。

(2）将截留有细菌的滤膜面向上平贴于品红亚硫酸钠培养基上，倒置37℃恒温箱内培养24h，挑选深紫黑色有金属光泽、紫黑色不带或略带金属光泽的菌落或淡紫红色、中心色较深的菌落进行革兰氏染色观察。

(3) 经染色证实为革兰氏染色阴性无芽抱者，再接种乳糖蛋白陈培养液，经37℃培养24h，产酸、产气者判定为大肠杆菌群阳性。

3. 粪大肠菌群的检测

方法与总大肠菌群的检测方法相同，培养温度为（44.5±0. 5)℃。

五、数据处理

1．多管发酵法

根据阳性管数组合（数量指标），查表4-39-2，并按初发酵实验接种水样量换算后，报告每升水样的总大肠菌群数。

2．滤膜法

根据滤膜上证实的20-60个／片大肠杆菌群数的水样量，计算每升水样中所存在的总大肠菌群数。计算公式为

每升水样中总大肠杆菌群数＝滤膜上生长菌落数×1000／过滤水样量（mL)

六、注意事项

(1) 严格无菌操作，防止污染。

(2) 注意正确投放发酵倒管，接种前小倒管中不可有气泡。

(3) 注意控制革兰氏染色的脱色时间。