一、目的和要求

(1)了解发光菌的生物毒性测试方法和基本原理。

(2) 掌握发光菌的基本培养方法和生物毒性测定仪的基本结构和原理，并能进行正确的操作和使用。

二、原理

发光菌的生物毒性测试是20世纪70年代建立的生物测试方法。发光菌是一种海洋发光细菌，属非致病的革兰氏阴性兼性厌氧细菌，它们在适当条件培养后，能发出肉眼可见的蓝绿色光。细菌的发光过程是菌体内一种新陈代谢的生理过程，是呼吸链上的一个侧支，即菌体是借助活体细胞内具有ATP,荧光素（FMN)和荧光素酶发光的。综合化学反应过程为

                            细菌荧光酶

FMNH2 +RCHO+O2————→FMN+RCOOH+H2+hv

该光波长为490nm左右。这种发光过程极易受到外界条件影响。凡是干扰或损害细菌呼吸或生理过程的任何因素都能使细菌发光强度发生变化。当有毒物质与发光菌接触时，发光强度立即改变，并随着毒物浓度的增加而发光减弱。这种发光强度的变化，可用一种精密测光仪测定。美国Microbics公司设计制造了一套微毒测定仪器。中国科学院南京土壤研究所、华东师范大学生物学系也分别成功地研制了DXY-2型生物毒性测试仪和SDJ-1型生物发光光度计。

目前，国内外采用的发光细菌实验有三种测定方法：①新鲜发光细菌培养测定法。②发光细菌和海藻混合测定法。③冷冻干燥发光菌粉制剂测定法。本实验采用新鲜发光菌培养法或冷冻干燥发光菌粉制剂法检测环境样品的生物毒性。

三、仪器与试剂

(1) DXY-2型生物毒性测试仪。

(2）恒温磁力搅拌器。

(3）培养液。

酵母浸出汁                               0. 5g

胰蛋白陈(tryptone)                    0.5g

NaCl                                       3. 0g

Na2 HPO4                               0. 5g

KH2PO4                                  0. l g

甘油                                        0. 3g

蒸馏水                                加至100mL

pH调至7±0.5，经121℃，151b/ln215min高压灭菌后置冰箱备用。

(4）固体培养基。

上式培养液                            100mL

琼脂粉                                   2. 0g

pH调至7±0.5，经121 ℃，151b/in215min高压灭菌后置冰箱备用。

(5）稀释液。

3%NaCl溶液                            500mL

2% NaCl溶液                              l0mL

(6）参比毒物。0. 02-0. 24mg/L HgCl2系列标准溶液。

(7）待测物。视需要而定（化学毒物或综合废水）。

(8）实验生物。新鲜明亮发光杆菌（Photobaclerium phosphortum) T3变种或明亮发光杆菌冻干粉，均由中国科学院南京土壤研究所微生物室提供。

四、实验步骤

1．菌种准备

1) 发光细菌新鲜菌悬液的制备（第1法）

(1) 斜面菌种培养。于测定前48h取保存菌种，于新鲜斜面上接出第一代斜面，(20±0.5)℃培养24h立即转接第二代斜面，(20±0.5)℃培养12h，再接出第三代斜面，(20±0.5)℃培养12h后备用。每次接种量不超过1接种耳。

(2）摇瓶菌液培养。取第三代斜面菌种近1环，几接种于装有50mL培养液的250mL三角瓶内，(20±0. 5) ℃ ,184r/min下培养 12-14h，备用。

(3) 将培养液稀释至每毫升108一109个细胞，初始发光度不低于800mV，置冰浴中备用。

2）菌液复苏（第2法）

取冷藏的发光菌冻干粉，置冰浴中，加入0. 5mL冷的2 % NaCl溶液，充分摇匀，复苏2min，使其具有微微绿光，初始发光度不低于800mV。

2．样品采集与处理

1) 水样

(1) 从不同工业废水的各排放口，每4h采样一次，每次取样后于4℃保存，连续采集24h后，均匀混合后备用。

(2) 纳污水体取其入口、中心、出口三个断面混合水样备用。

(3）以同上方法采集清洁水，作空白对照。

浊度大的污水，需静置后取上清液。一般样品不需加任何处理。水样按3%比例投加NaCl，置冰箱备用。

2) 气体样品

以大气采样法采取一定体积的大气样品，通过气体吸收液（(5mL)中吸收，按3％比例投加NaCl，置冰箱备用，同法收集清洁空气作为对照组。

3) 固体样品

取固体废弃物，按《工业固体废弃物有害特性试验与监测分析方法》制备浸出液，取上清液，按3％比例投加NaCl，置冰箱备用。

3．实验浓度的选择

在预备实验的浓度范围内，按等对数间距或百分浓度取3-5个实验浓度，同时设空白对照和参比毒物系列浓度组。

4．发光细菌法生物毒性浏定

1) 工业废水或有毒物质的生物毒性测定

(1) 发光菌悬液初始发光度测定。取4. 9mL 3%NaCl溶液于比色管内，加新鲜发光菌悬液或冻干粉复苏菌悬液10μL，若测量发光度在800mV以上，允许置冰浴中备用。

(2) 取已处理待测废水样品，按等对数间距或百分浓度编号，并注明采集点。

(3) 按表4-40-1依次加入稀释液，待测水样及参比毒物系列浓度溶液。

(4) 打开生物毒性测试仪电源，预热15min，调零点，备用。

(5) 每管加入菌悬液10μL，准确作用5 min或15min，依次测定其发光强度，记录毫伏数。

每个浓度设3管重复。

2) 工业废气（或有害气体）的生物毒性测定

(1) 气体直接通入法。用注射器直接注入气体于菌悬液中，经10-20min测定发光菌强度的变化。

(2) 气体吸收法。方法同工业废水测定法。

(3) 固体菌落法。挑选固态培养对数生长期的发光菌单菌落，连同培养基切下，置比色管内，测定初始发光强度，然后用注射器将待测气体注入菌苔表面，经10-20min后，测定发光度的变化。

五、数据处理

1．记录工业废水、废气的生物毒性实验数据及其计算

1) 相对发光率或相对抑光率

计算公式；

相对发光率T(%）= 样品发光强度/对照发光强度× 100%

相对抑光率T(%）=（对照发光强度—样品发光强度）/对照发光强度×100%

2) EC50值

在半对数坐标纸上，以对数浓度为横坐标，以相对抑制或发光率为纵坐标，作图求得EC50值。

2．处理与评价

(1) 建立相对抑光率与参比毒物系列浓度的回归方程，求出样品的生物毒性相当于参比毒性的水平，以评价待测样品的生物毒性。

(2）以EC50值评定样品的生物毒性水平。

六、注意事项

(1) 斜面菌种，摇瓶菌液避光于黑暗中保存。

(2）在转换培养中，菌种接种量不得超过1环，过多影响发光度。

(3) 比色管、容量瓶应用硝酸（1：1)洗涤。