一 分离原理

体积排阻或排除色谱(size一exclusionchromatography,SEC）亦称为凝胶色谱或凝胶过滤色谱，是分析高分子化合物的色谱技术。SEC填料为微粒均匀网状多孔凝胶材料。比填料平均孔径大的分子被排阻在孔外而无保留，被最先洗出；分子体积比孔径小的分子完全渗透进入孔穴，最后洗出；处于这两者之间具中等大小体积分子渗透进入孔穴，由于渗透能力差异而显示保留不同，产生分子分级，这取决于分子体积，在一定程度上亦与分子形状有关。因此，SEC分离是基于溶质分子体积差异在凝胶固定相孔穴内的排阻和渗透性大小。

多孔凝胶填料填充柱总体积Vt包括凝胶基质骨架体积坎，孔穴中溶剂体积Vs，凝胶颗粒间体积Vo等几部分：

Vt=Vg+Vs+Vo

这里Vs称为固定相体积；Vo称为柱内流动相体积。假设不存在组分再混合和扩散，Vo代表洗出被凝胶排阻的大体积溶质所需流动相溶剂体积。然而，事实上一定的混合和扩散可能发生，结果是无保留溶质显示一个最大浓度在洗出流动相体积为Vo的Gaussian谱带。小体积溶质可自由地渗透进入凝胶孔穴，洗出谱带最大浓度相应体积为（Vs十Vo)。一般Vs,Vo和Vg在同一数量级，则中等大小体积分子洗出体积介于（Vs+Vo）和Vo之间的Ve值：

Ve=Vo+KVs                                （1-1)

对体积太大以致不能进入凝胶孔穴的分子，K=0和Ve=Vo；对无阻碍地进入孔穴的小分子，K=1和Ve=Vs+Vo。式（1-1)重排得

K=(Ve-Vo)/Vs=cs/cm

K为溶质的分配系数。K值范围从完全排除的大体积分子K为0(Ve=Vo）到完全渗透的小分子溶剂K为1(Ve-Vo=Vs）之间。对比较不同填料性能，K是一个有价值的参数。应注意，分配系数K的含义与其他色谱方法的差别，这里K是溶质淋洗或保留体积占固定相体积的比例，其值总小于1。此外，不同于其他色谱方法，排阻色谱填料是惰性的，溶质和固定相凝胶之间不存在化学和物理吸附等相互作用，且尽量避免这种作用以免影响柱效。这种色谱方法存在保留时间上限，没有溶质保留时间能大于完全渗透固定相的溶质洗出时间。

对SEC填料适用的相对分子质量范围可方便地从校准曲线来说明。这里，直接与溶质分子体积有关的相对分子质量对保留时间与流动相体积流速乘积的保留体积VR作图。图中存在一个排阻极限点A，凡比此点相对分子质量大的溶质均被排阻，以保留体积为Vo的单一色谱峰a洗出。此外，还存在一个渗透极限点B，所有相对分子质量低于此点的溶质分子完全渗透，以单一峰d洗出。从A点随相对分子质量降低，溶质分子在凝胶孔穴中逐渐渗透，慢慢迁移。这是选择性渗透区，发生溶质按相对分子质量分级分离，形成系列色谱峰，如图中b,c等。类似图20-30理论校准曲线，以相对分子质量标准试样获得各种商品化填料的实验校准曲线由填料制造商提供。

二 体积排阻色谱柱填料和流动相

SEC经常使用的固定相有两种，即粒径5-10μm均匀网状孔穴的交联聚合物和无机材料，如多孔玻璃、硅胶基质等。后者具有机械强度和稳定性高、易填充、耐高压和高温、更换溶剂平衡速度快、适用溶剂范围广等优点。孔径范围0.004-0.25μm。其缺点是残余吸附导致溶质非排阻保留及催化作用引起溶质降解。为减少吸附，常采用硅烷化对表面改性，引进经基等亲水性基团。有机聚合物凝胶常用的是苯乙烯和二乙烯苯交联共聚物，由交联度控制孔径范围。最初聚合物是疏水的，只适用非水流动相，对水溶性高分子，如糖类等应用受到限制。现在通过聚苯乙烯磺酸化或制备聚丙酞胺可获得亲水性聚合物凝胶。

SEC可分为凝胶过滤和凝胶渗透色谱。前者使用亲水性填料和水溶性溶剂流动相，如不同pH的各种缓冲溶液；后者采用疏水性填料和非极性有机溶剂，最常用的是四氢呋喃，其次是二甲基甲酰胺、卤代烃等流动相。SEC不采用改变流动相组成来改善分离度，溶剂选择主要考虑对试样溶解能力及与固定相、检测器的匹配。

三 体积排阻色谱应用

SEC方法主要应用是分离测定合成和天然高分子产物。例如从氨基酸和多钛中分离蛋白质；测定聚合物的相对分子质量和相对分子质量分布。这常是其他色谱方法不能解决的课题。图是用多孔硅胶固定相分离测定聚苯乙烯相对分子质量分布色谱图。另一个用途是分离同系物和低聚物。如分离脂肪酸、脂肪醇同系物，聚乙二醇低聚体等。其次，亦可分离低分子化合物，如分离蔗糖、果糖、葡萄糖等。SEC不适用于分子体积相似的异构体分离。由于溶质与固定相不存在相互作用，因而不存在生物高分子分离中去活的缺点，此乃SEC的优点。