在实际工作中吸光度测定法是使用最多的测量方式，凡是在可见光区或紫外光区有吸收的化合物均可用此法进行测定。一般来说以钨灯、氖灯及汞灯为光源，在通过选用适当的滤光片（对滤光片型扫描仪）或者调节单色器的波长调节钮（对单色器型扫描仪）来实现波长的设定。吸光度测定法包括透射法、反射法、反射一透射法三种。

1．透射法

光源与光电检测器安装在薄层板的两侧，光源发射光通过单色器或滤光片后成为波长固定的单色光，光束照在薄层斑点上，测量透射光强度。该法灵敏度较高，但对薄层的均匀度要求较高，基线噪声大，信噪比小。在短波测定范围内，普通玻璃板对紫外光有吸收，因此使用较少。

2．反射法

光源与光电检测器安装在薄层板的同侧。光源发出的光经过单色器或滤光片后成为波长固定的单色光并照在薄层板上，然后通过测量反射光的强度进行测定，这种方法灵敏度较低，但对薄层厚度要求不高，基线比较稳定，重现性较好，但信噪比较大。由于不受玻璃板对短波有吸收的限制，在紫外可见光范围均可测定，因此在实际应用中使用较多。

3．反射一透射法

同时测定反射光和透射光的强度，将测得的两种信号相加。该法可以部分补偿由于薄层厚度均匀所造成的测量误差。因此基线平稳、测量误差小，灵敏度较高。但由于仪器结构比单独测定反射光或透射光复杂，实际中已较少应用。