骨髓作为主要的造血场所，可见到造血干细胞不同分化阶段中的各种血细胞的前驱细胞。用通常的形态学方法不可能识别造血干细胞和各种血细胞的前驱细胞，但在加入各种造血因子的半固体培养基中进行培养，可出现单个前驱血细胞的增殖和分化，并形成细胞克隆。用此法可以鉴定构成克隆的血细胞种类，并根据克隆形成单位（colonyforming unit, cfu )的大小来判定前驱血细胞的分化与增殖能力。这种克隆形成法能有效地对前驱血细胞与造血因子进行定性与定量，是分析血细胞分化机制的主要方法。

【材料】

1．组织来源小鼠（B6D2F1,C57BL/6等）2只。

2.培养基。α-MEM培养基（用DEM、F12,McCoy 5A等也可以），胎牛血清（FBS)、琼脂等。

3. Turk液（白细胞稀释液），血细胞计算器一套。

4．器具解剖用具，各种吸管，试管，25G注射针，2.5 ml注射器，90mm平皿，35mm塑料培养皿，倒置显微镜，解剖显微镜。

【方法】

1．条件培养基（conditioned medium）的制备取一只小鼠用作制备条件培养基。先将小鼠麻醉致死，全身浸泡于75％乙醇中消毒，无菌解剖小鼠并取出腹膜，放入90mm塑料平皿中，加l0ml含有20% FBS的a-MEM培养液，置37℃,5% C0₂孵箱内培养3天后，将腹膜培养液滤过除菌，-20℃冻存，此条件培养基中含粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF)。

2．软琼脂培养基制备取琼脂30mg放入试管中，加蒸馏水3 ml, 103.4kPa高压灭菌，待冷却至50～60℃时加入等量的2倍浓度的。a-MEM培养液，使成1.5％的半固体琼脂，混匀后，置42℃水浴中保温。

3．骨髓细胞的制备 取另一只小鼠，经麻醉处死，消毒后，无菌取出左右两侧大腿骨，去除周围肌肉组织后放入35 mm塑料培养皿中，切除两侧骨的端部，用吸有。a-MEM培养液的注射器冲压出骨髓于一小试管中，用吸管吹打后放置5～10分钟，将悬浮的细胞移植到另一试管中。取细胞悬液0.1 ml与Turk白细胞稀释液0.9ml混合，用血细胞计算板计数有核细胞数。根据计数，用a-MEM培养液将骨髓细胞浓度稀释成5x10⁵个／ml。

4．细胞接种取骨髓细胞悬液0.5 ml，条件培养液0.5 ml及胎牛血清1 ml混合于小试管中。加软琼脂培养基3m1 (42℃)，迅速混合后分别注入4支35mm塑料培养皿中，每支1 ml。使整个平皿底部铺平（此操作的动作要快，温度不能太低，注意琼脂不能在未分装前就凝固于试管中）。静置5～10分钟后琼脂板可完全凝固成半固体，置37℃,5% C0₂孵箱内培养7天。

【结果】

培养6～7天，骨髓细胞可在软琼脂培养基上形成集落，在显微镜下进行观察，并于低倍率（40x～100x )的倒置显微镜或解剖显微镜下计数克隆数。通常由50个以上的细胞才能形成一个克隆，并以克隆组成的形态而分类为集块型（A)、扩散型（B）和混合型（C)等三种（图4-9)。