小脑是中枢神经系统中最大的运动器官中枢，主要作用是维持躯体平衡，调节肌肉张力和协调随意运动。小脑的另一个与运动有关的重要功能是在技巧性运动的获得和建立过程中发挥运动学习的作用。小脑由外层的灰质（皮质）、内部的白质和三对深部的核团（顶核、间位核和齿状核）组成。与大脑皮质相比，小脑皮质的结构和神经元环路的组成相对简单，整个小脑皮质共有三层结构：分子层、普肯耶细胞层和颗粒层。其中含有五种神经元，即颗粒细胞，普肯耶细胞、篮状细胞、星形细胞和高尔基细胞。在体外培养系统中，小脑细胞大小和形态的特征明显，容易识别，小脑细胞体外培养方法的建立为观察和研究神经元的迁移过程提供良好的模型。另外，小脑缺陷神经突变的小鼠种系比较多，这些条件都使小脑细胞成为发育研究的良好对象。

【材料】

1．组织来源新生（出生8天内）清洁级（specific pathogen free, SPF）小鼠。

2．培养用液

（1）无钙、镁Tyrode’s溶液（CMF-Tyrode’s)：

溶液1 NaC18.0g,KCIO.3g,葡萄糖2.Og溶于500ml水中。

溶液2 NaH₂P0₄·H₂O 0.05g,KH₂P0₄ 0.025g，溶于480m1水中。

将溶液1和2混合后，加入0.5％的酚磺酞0.5ml，高压灭菌，分装后4℃保存。使用前加入5% NaHC0₃ 2ml，充以5% C0₂/95 % N₂调节pH至7.2（充气时注意无菌操作）；

(2)消化液：胰蛋白酶1g, DNA酶0.1 g ,CMF-Tyrode' s液100m1,混匀后用220nm滤膜过滤、分装，保存于-20℃。

(3）细胞分离液：DNA酶0.1g,葡糖糖0.2g, BME (Eagle's基础培养液）100ml,混匀后用220nm滤膜过滤，分装，保存于-20℃。

(4）细胞生长液：BME培养液含有2mmol/L谷氨酰胺、0.1％葡萄糖、251U/ml青霉素、25 ug/ml链霉素、10％马血清或10％胎牛血清（FCS)。

(5)其他：多聚-D-赖氨酸100ug/ml。

3.器具 24孔培养板或35 mm培养皿、Lab-Lek培养玻片（Nunc.lnc)，荧光显微镜、倒置显微镜，co₂孵箱，解剖显微镜，手术刀、剪、镊等手术器械。

【方法】

1．细胞制备在无菌条件下取脑、分离出双侧小脑。小脑神经细胞的制备关键问题是操作速度，从取脑、分离小脑组织、制备单细胞悬液，并接种到培养器皿中，其操作速度越快，培养细胞的存活率就越高。

(1)手术取小脑：选用新生8天以内的SPF清洁级小鼠（出生超过8天的小鼠，其小脑细胞存活将大幅降低），用脱颈法处死动物，然后用75％乙醇消毒头颈部皮肤，剪开头颅，取出全脑移入装有CMF-Tyrode' s液的平皿内。在解剖显微镜下小心剪除小脑的脑膜，从上丘和下丘处分离小脑，并剪除连接于小脑和脑干的蒂，在CMF-Tyrode' s液中洗除小脑残余的脑膜和血管，并将洗净的小脑组织移入另一个含有CMF-Tyrode' s液的平皿中。

(2)消化组织：将小脑组织剪成2mm×2mm×2mm大小的组织块，移入含有2ml CMF-Tyrode' s液的无菌锥底离心管内，用CMF-Tyrode' s液漂洗3次后，吸去CMF-Tyrode' s液，加入1 ml消化酶混合，混育消化。消化时间要依鼠龄而定，出生当天的约为5分钟，此后鼠龄每多1天需相应增加1分钟，即出生7～8天约需消化14分钟；出生8天以后的因很难培养成功，就不要采用了。

(3)吹打组织：被消化的组织易聚积沉淀，吸去消化液，用预冷的CMF-Tyrode' s液洗净剩余的消化液，共漂洗3次。加入1 ml细胞分离液（因破损的细胞释出的DNA将黏附完整细胞的表面，使细胞黏聚在一起形成不易分散的团状，而分离液中的DNA酶将有助于分散细胞），用口径略粗的玻璃吸管（吹打管）轻轻吹打组织数十次。

(4）收获细胞：将离心管置冰浴2分钟，让未完全分散的大组织团块下沉，小心地吸取上段的细胞悬液于另一离心管中，以800～1000r/min离心5分钟，沉淀细胞。弃去含有细胞碎片和缺损的死细胞的上清液，将沉淀的细胞再悬浮于0.5～1.0ml生长培养液中。一般出生当天小鼠的一个小脑组织可获得106个细胞，出生4天的小鼠小脑可获得将4X10⁶个细胞，出生7～8天小鼠的小脑可获得(1.0～1.5)x10⁷个细胞。尽管出生时间越长的鼠脑获得的细胞数越多，但培养的成活率越低，出生8天以上的鼠小脑细胞在体外就很难成活。

2．细胞培养器皿的准备

(1)器皿选择：根据实验情况选择培养器皿，尤其在分离获得的细胞数量有限而又必须进行复孔实验时，可使用％孔培养板进行重聚集和单层细胞培养。当生化实验需要较多的细胞时，可选用24孔培养板或更大的培养器皿（如35 mm平皿）。

(2)培养皿预处理：对于重聚集培养，不需对培养器皿进行任何预处理；而对于单层细胞培养，塑料或玻璃器皿的表面均需加入多聚-D-赖氨酸（100ug/ml水溶液）包被，并于室温包被至少2小时，然后用灭菌的去离子水漂洗5次，置于超净工作台内进行空气干燥。

3．细胞分装与培养

(1)分装：对于重聚集培养，可将收集的细胞悬液用生长培养液稀释至5x10⁶个细胞／ml。并在每个微孔内接种10ul，即接种5x10⁴个细胞／孔。对于单层细胞培养，可将细胞悬液稀释至1x10⁶个／ml，每孔接种10ul，即接种1x10⁴个细胞／孔。较高密度接种的细胞，将迅速产生条件培养液而促进细胞的存活。若要接种较大的培养皿可按比例加大接种体积。

(2)细胞培养：将接种好的培养器皿置于37℃,5% C0₂孵箱中培养，孵箱保持饱和湿度。因微孔板中接种培养液仅10ul，应注意孵箱内的湿度变化，小心避免培养液的蒸发，在盖上培养板之前，最好在微孔板的四周或中间的孔与孔间的凹槽中加入CMF-Tyrode' s液，以维持孵箱内的饱和湿度。

【结果】

培养的小脑神经元以颗粒细胞为多见，体积较小，直径3～5 um，亦可见到一定数量的星状细胞，普肯耶细胞和篮状细胞（胞体直径6～8um)，它们均随着培养时间的延长，神经元胞体逐渐增大，突起逐渐增粗。

1．重聚集培养在培养3～4小时内，细胞将聚集成不同大小的细胞团，这些细胞团主要由颗粒细胞（约占60％～80%)、其他类型的小脑神经元及非神经元细胞组成。培养12～14小时后，细胞之间开始出现相互联系，24～48小时后细胞团间由平行纤维束和星形胶质细胞形成连接。平行纤维束和星形胶质细胞不贴附于培养皿，而是悬浮连接在重聚集的细胞团之间，随着培养时间的延长，平行纤维束和实起的数量在增加。颗粒细胞呈簇状紧贴着纤维束的表面，并沿纤维束表面移行，类似于在体内迁移的颗粒细胞。培养72小时之后，迁移的颗粒细胞数量达到其峰值，随后，重聚集细胞团内小脑细胞的轴突和树突开始发育，其尖端均有生长锥，并在突起间形成许多突触。平行的纤维束和颗粒细胞聚集成簇状，类似于小脑原位组织细胞的迁移，再现小脑神经元的迁移过程。

2．单层细胞培养细胞接种后30分钟内开始黏附于底物，6～9小时内细胞长出突起，24小时后神经纤维发育并形成致密的网络。单层培养的细胞核和突起紧密地黏附于底物，这一特色与重聚集培养细胞不同。尽管最初接种的各类细胞是随机分布的，但随后颗粒细胞和星形胶质细胞之间的相互作用出现细胞类型和发育阶段的特异性，处于迁移阶段的颗粒细胞偏好附着于星形胶质细胞伸长的突起并移动，迁移后的颗粒细胞则主要与辐射状星形胶质细胞相连。