新生兔肾细胞的制备与培养

【材料】

1．兔婴（出生48小时内尚未进食兔婴，体重300～500g)。

2．培养基与试剂 含10% FBS（或CS）的MEM,CMF-Hanks液、0.25%胰酶/CMF-PBS。

3．器具各种吸管、离心管、80～100目尼龙网或不锈钢筛网、三角烧瓶、培养皿、瓶，手术刀、剪、镊,1％苯扎溴铵消毒缸、解剖板等。

【方法】

1．取肾 取2日龄内兔婴，将其断颈处死后，放入1％苯扎溴铵溶液中浸泡10分钟。取出兔婴，用碘酊、乙醇消毒背部皮肤，解剖取肾，除去肾被膜，放无菌平皿内用Hanks液洗净。

2．组织处理及消化剪下肾皮质部分，移入小三角烧瓶内，用小剪细剪成1 mm³左右的组织块，用Hanks液洗3次，吸弃上清液，视其沉下的组织块量，约加10倍量的0.25%胰酶，于37℃水浴中消化30分钟。以下步骤及方法与鸡胚细胞制备相同，不赘述。

3．细胞计数与分装取上述获得的单细胞悬液少量，进行1:5或1:10稀释后计数，然后调至细胞浓度为(0.5～1)x10⁶/ml，分装培养瓶内。

4．培养和观察将上述培养物置37℃,5% CO₂孵箱中培养，逐日观察细胞生长情况，一般于次日可见细胞贴壁生长，此时换液，弃去未贴壁的细胞及细胞碎片，2～3天后可长成单层细胞，换维持液后即可用于试验，或经传代后再长成单层时使用。

【结果】

一般肾细胞在2～3天可长成单层细胞供使用。肾细胞之间可能混有血细胞，经过几次传代后，可以除去。

【注意事项】

初学者在细胞接种培养前须经细胞计数，可能会耽误一些时间而影响细胞的活性，待对细胞培养有一定经验后，可省略细胞计数步骤，视其悬液的透明度来估计细胞浓度。最初接种的培养瓶应尽量小些，而接种的细胞数应适量多些。