猪ES细胞系不仅可用于克隆动物、转基因动物、基因敲除动物及嵌合体动物等的生产，以及进行猪的品种改良或为医学研究提供实验动物模型，并可进行细胞分化与胚胎发育机制的研究以及各种基因功能分析。由于猪与人在解剖结构、生理等方面十分相似，所以猪胚胎干细胞还可应用于制造人类移植用的器官等方面。

【材料】

1．组织来源五指山猪（孕9～10天胚胎），STO细胞为饲养层。

2．培养用试剂

(1）冲胚液：DMEM培养液，含10% CS和25 mmol/L羟乙基哌嗪乙磺酸（hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic acid，HEPES )。

(2)消化液：0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA混合消化液，用无钙镁PBS配制，pH 7.4。

(3）丝裂霉素C储存液（0.5～1.0g/L, PBS配制）。

3．培养基配方和制备DMEM含有10％胎牛血清（fetal bovine serum, FBS ) ,10％新生牛血清（newborn bovine serum, NBS) ,1000IU/ml LIF, 30ng/ml干细胞生长因子（stem cell growth factor, SCF),20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF)。

4．实验器材眼科直剪、眼科直镊、眼科弯镊、玻璃平皿、200目尼龙网、50ml和15m1离心管、手术刀片。

【方法】

1．取材取受孕9～10天胚胎，以冲胚液冲洗子宫角，收集胚胎，PBS冲洗3次。将囊胚放入铺有饲养层细胞STO的4孔培养板上（经过丝裂霉素C预处理），每孔1枚，每孔加ES培养液，置37℃,5% CO₂饱和湿度的培养箱中培养。培养4～5天后，待内细胞团充分增殖且未出现分化时，无菌玻璃针拨动形似鸟巢状的内细胞团，使其与滋养层细胞分离。

2．消化Hanks液洗细胞团2次，用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA消化细胞团5分钟，吸管将细胞团打散，加ES培养液终止反应。

3．接种与培养细胞计数，将细胞以3x10⁶个／ml密度接种至制备预先铺有饲养层细胞的培养皿上，37℃,5% CO₂饱和湿度孵箱中培养。如此每隔2～3天重新传代1次。

【结果】

分散的内细胞团培养3～6天后，可见许多细胞集落，细胞折光性强。随着培养时间的延长，集落体积逐渐变大。

【注意事项】

孕9～10天的猪胚胎细胞贴壁率高，适用于猪胚胎干细胞的分离与传代培养。