BrdU为胸腺嘧啶的衍生物，全名5-溴脱氧尿嘧啶核苷，细胞增殖时BrdU可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期）加入细胞，而后利用抗BrdU单克隆抗体，ICC染色，显示增殖细胞。同时结合其他细胞标记物，双重染色，可判断增殖细胞的种类及增殖速度。

【材料】

1. BrdU;抗小鼠BrdU单抗。

2. RPMI 1640；兔血清、PBS。

3. ABC法所用的试剂；甲醇／醋酸、0.3% H₂0₂-甲醇、甲酰胺。

【方法】

1．转化的淋巴细胞以1.5x10⁵/ml细胞数接种于直径35 ml培养皿中（内放置一盖玻片），培养1天，用含0.4% FCS培养液同步化3天，使绝大多数细胞处于GO期。

2．终止细胞培养前，加入BrdU（终浓度为30WL) ,37℃，孵育40分钟。

3．弃培养液，玻片用PBS洗涤3次。

4．甲醇／醋酸固定10分钟。

5．经固定的玻片空气干燥，0.3% H₂0₂-甲醇30分钟灭活内源性氧化酶。

6. 5％正常兔血清封闭。

7．甲酰胺于100℃变性核酸5分钟。

8．冰浴冷却后PBS洗涤，加1抗即抗小鼠BrdU单抗（工作浓度1:50)，阴性对照加PBS或血清。

【结果】

按ABC法进行检测，苏木素或伊红衬染，在显微镜下随机计数10个高倍视野中细胞总数及BrdU阳性细胞数，计算标记指数（LI)。

【注意事项】

1. BrdU是光敏型，所以必须在黑暗中加入。细胞加了BraU以后也可能光敏感，因此也在黑暗中培养。

2．所有的沉淀细胞步骤为4000rpm, 2分钟。

单向混合淋巴细胞培养

混合淋巴细胞培养（mixed lymphocyte culture, MLC）或称混合淋巴细胞反应（MLR)，是将两个无关个体的淋巴细胞混合在一起培养，由于两者的淋巴细胞膜上的组织相容性抗原不同，可互相刺激，导致对方的淋巴细胞分裂增殖和转化。若将其中一方的淋巴细胞先用丝裂霉素C(mytomycine C)处理或射线照射使之细胞中DNA失去复制能力，但仍能刺激另一方淋巴细胞发生转化，称为单向混合淋巴细胞培养（one way MLC)。

【材料】

1．淋巴细胞悬液：浓度调至1x10⁶/ml。

2．丝裂霉素C：用培养液或PBS配制30O ug/ml。

3．含20% NCS的RPMI 1640完全培养液。

【方法】

1．取淋巴细胞1x10⁶，加入最终浓度为30ug/ml的丝裂霉素C，于37℃水浴中作用30分钟，1000r/min离心10分钟，弃上清液，沉淀细胞用Hanks液洗涤3次。

2．将分离的PBMC调整细胞浓度为1x106/ml。

3．将上述两种细胞各0.2m1，加入1.8ml含20% NCS的RPMI 1640完全培养液中，置37℃培养6天。

【结果】

增殖反应的检测：同前述淋巴细胞增殖反应的检测。

【注意事项】

1．注意无菌操作。

2.束1激细胞接受照射剂量要准确，使细胞暂时存活，但失去增殖的能力。