淋巴细胞的某些亚群等免疫效应细胞具有杀伤靶细胞的细胞毒作用，这些细胞能杀伤外来异物如细菌、病毒等微生物及自身产生的异常细胞如肿瘤细胞等。具有细胞毒作用的淋巴细胞通常有：细胞毒性T淋巴细胞（CTL)、自然杀伤性细胞（NK)、淋巴因子活化的杀伤细胞（LAK）等。这些细胞对靶细胞有直接的细胞毒作用。检测方法有很多，包括形态检查法、放射性核素法、乳酸脱氢酶释放法、四氮唑盐法等。

一、形态学检查法（淋巴细胞对肿瘤细胞的细胞毒试验）

【原理】

效应T淋巴细胞在体外与靶细胞相互作用时，可表现出破坏和杀伤靶细胞的特性，靶细胞可以是肿瘤细胞或其他组织细胞。淋巴细胞杀伤靶细胞的方式可通过直接杀伤或产生淋巴因子间接破坏靶细胞。细胞毒的形态学检查法不需特殊设备，只需用显微镜计数靶细胞的存活数，操作简单方便。

【材料】

1．淋巴细胞悬液：浓度调至1x10⁶/ml ;

2．肿瘤细胞悬液；

3．含20% NCS的RPMI 1640完全培养液；

4．胎牛血清。

【方法】

1．肿瘤细胞培养物制成悬液，并稀释至需要的细胞浓度。

2．于24孔板每孔中接种0.2ml肿瘤细胞（内含5x10²个细胞）,37℃培育24小时。

3．细胞贴壁后，轻轻弃去培养液，加1 ml PBS洗涤，弃去洗涤液及未贴壁细胞。

4．向小孔分别加入0.2m1不同浓度的淋巴细胞（分别含有5x10⁵个细胞，5x10⁴个细胞，5x10³个细胞），使淋巴细胞与癌细胞之比依次为1000:1,100:1,10:1。

5. 45分钟后加0.1 ml 5％胎牛血清，37℃继续培养2～3天。

【结果】

2％锥虫蓝染色，翻转24孔板，计数活的肿瘤细胞，并设正常人淋巴细胞作对照，每份做3个复孔，分别检查各孔中存活细胞数，按下列公式计算淋巴细胞的细胞毒。

二、51 Cr释放法（NK细胞毒试验）

【材料】

1．效应细胞的制备常规方法分离NK细胞，计数活细胞数，使细胞浓度为5x106/ml,细胞存活率为95％以上。

2.靶细胞制备和标记用RPMI 1640培养液洗涤107靶细胞，去上清液。用0.5 ml不含碳酸氢钠的完全培养液悬浮细胞。加入100uCi(3.7MBq)51Cr铬酸钠，37℃水浴中标记1小时，每5～10分钟摇晃一次，混匀细胞。用RPMI 1640培养液洗涤细胞3次，用50ml RPMI1640培养液悬浮细胞，置37℃水浴30分钟，以减少非特异的自然释放。离心去上清液。小心用RPMI 1640培养液悬浮细胞，尽量减少振荡引起的细胞损伤以降低靶细胞的自然释放率，将细胞浓度调整为0.5x10⁵或1x10⁵/ml备用。

【方法】

1．在96孔细胞培养板中每孔加入100ul51 Cr标记的靶细胞。

2．向各孔加100ul效应细胞，效应细胞与靶细胞的比例（效靶比，E:T）通常为5:1～20:1。阴性对照孔（自然释放）不加效应细胞只加等量完全培养液，阳性对照孔（最大释放）中加100 u1 1 % NP40（或2% SDS,1mol/L盐酸）。每组设三个复孔。稍稍离心（500r/min, 3分钟）后，置37℃,5% CO₂的二氧化碳孵箱中培养4小时。

3．离心培养板800r/min, 10分钟，每孔吸出100ul上清液置一次性使用的检测管中，在γ-计数仪上（或液闪计数仪上）测定上清液中的每分钟放射性活性（cpm值）。

【结果】

特异性杀伤活性用细胞毒性百分比表示：细胞毒性（％）=[（实验组cpm-自然释放组cpm)/（最大释放组cpm-自然释放组cpm)]x100%。

【注意事项】

1．根据预试验确定效应细胞／靶细胞的最佳比例。

2．注意防护核素放射性污染。