5-125碘-2脱氧尿嘧啶核昔(125l-UdR）分子上的碘原子与胸腺嘧啶核苷的甲基在空间构形上极为相似，因此可将1251-UdR分子掺入到细胞核DNA链上的胸腺嘧啶位置上，来标记靶细胞。当标记的肿瘤靶细胞被攻击死亡后，靶细胞内的125 I-UdR释放入培养液中，释放的核素几乎不再被活细胞利用。所以测定培养液中释放的核素量或残留细胞中的核素量即可换算出死亡的肿瘤细胞数。

【材料】

1. 25I-UdR；

2．塑料微孔板、培养瓶；

3．带微孔板支架的离心机、核素测试仪；

4．其他试剂和材料与形态学方法相同。

【方法】

1．将对数生长期的肿瘤细胞用0.25%胰蛋白酶消化3～5分钟，洗涤后配制成10⁶/ml的肿瘤细胞悬液。

2．每培养瓶中加入细胞悬液6m1，置37℃细胞培养箱内培养24小时。

3．加入2220kBq125 1-UdR ,6小时后（靶细胞的种类不同，掺入时间也不同）弃去上清液，Hanks液洗涤，通常每个细胞掺入量为0.5～1.Ocpm的125 I-UdR。

4．将标记细胞0.2ml(4x10³个细胞）分别加入塑料微孔板小孔内，37℃ C0₂孵箱中孵育20分钟，标记细胞在塑料板微孔内贴壁率应超过70% 。

5．将分离所得淋巴细胞配成2.5x10⁵/ml细胞后取0.2ml，分别加入上述贴壁靶细胞小孔内中。效靶比为100:1，每一样品重复3份。

6．置于37℃,5% C0₂培养箱内，培养48小时。

7．去上清液，用培养液重悬细胞后经500r/min离心5分钟，洗涤两次。

【结果】

用核素测试仪分别测定各管一分钟脉冲数（cpm )。将正常人淋巴细胞（或对照组淋巴细胞）与肿瘤靶细胞作用后小孔内残存脉冲数（取其平均数）作1，与同批实验中的实验组的值相比，得出细胞毒性指数。

乳酸脱氢酶释放法（NK细胞毒实验）

NK细胞与K562靶细胞在体外孵育，靶细胞被破坏后，线粒体内的乳酸脱氢酶( lactate dehydrogenase）释放出来，使底物发生颜色变化，其颜色深浅与酶的释放量及死亡细胞数成正比，检测显色后的OD值，便可推算出NK细胞的杀伤活性。

【材料】

1．细胞靶细胞为K562细胞，效应细胞为淋巴细胞；

2．培养液BPMI 1640培养液；

3. LDH底物溶液（临用前配制）硝基氯化四氮唑蓝（NBT) 4mg，氧化型辅酶I 10mg,吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS)1mg，加蒸馏水2ml溶解，混匀后取上液1.6ml加1 mol/L乳酸钠0.4ml，然后加入0.1 mol/L pH 7.4 PB至l0ml;

4. 1% NP-40用RPMI 1640培养液配制；

5. 1mol/L枸橼酸终止液。

【方法】

1．将K562细胞在含RPMI 1640培养液中，于37℃,5% C0₂的细胞培养箱内培养2～3天。

2．取待检者肝素抗凝血3～5 ml经淋巴细胞分离液分离单个核细胞，为效应细胞。

3．用RPMI 1640培养液将效、靶细胞调成浓度为效：靶比例为20:1(例如4x10⁶/ml:2x10⁵ ml）备用。

4．在96孔板中将20:1的效靶细胞加入每孔，自然释放孔不加效应细胞只加100ul培养液，最大释放孔中加100ul 1% NP40。每个实验置3个复孔。37℃ 5% C0₂的二氧化碳培养箱中培养4～6小时。

5．取出培养板，吸取各孔上清液0.1 ml于另一培养板孔中，置37℃预温10分钟，每孔加入新鲜配制的底物溶液0.l ml，室温避光反应10～15分钟。每孔加入1 mol/L枸橼酸终止液30ul，以终止酶促反应。

【结果】

在酶联检测仪上测定各孔的OD值，检测波长492nm，参考波长650nm。特异性细胞毒的计算：

细胞毒（％）=[(OD实验组-OD总自然释放）/(OD最大释放组-OD总自然释放）]x100%。

【注意事项】

1．靶细胞一定要选择对数生长期细胞，活细胞应大于95%。淋巴细胞用新鲜活细胞，分离纯度越高越好。

2．无菌操作以免污染影响结果。

3．底物一定要现用现配。