动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS)是多因素、多细胞相互作用的结果，发病机制复杂。损伤学说认为，机械、化学、免疫、感染等引起血管内皮细胞（vascular endothelial cells, EC）损伤是动脉粥样硬化的起始因素，反复的内皮损伤引起单核巨噬细胞、血小板黏附，可致AS斑块形成。细胞培养是研究这一疾病最有效方法之一，在阐明AS的病因及发病机制中有很重要的地位。不同动物血管组成、性质不同，不同研究者实验目的不同，所采用的方法也不尽相同。随着研究的深入，细胞培养的方法和手段也会不断改进和发展。

（一）血管内皮细胞保护药试验

【原理和目的】

血管内皮细胞为覆盖在血管内表面的单层扁平细胞，覆盖在血管床内腔表面，具有机械及代谢功能。内皮细胞不仅是位于血液和血管壁之间的一个选择性通透屏障，而且作为一种内分泌器官分布于全身各组织，参与机体内多种代谢过程。因此，血管内皮细胞的剥脱、损伤和功能紊乱在AS的发生、发展中起着重要作用。对血管EC构成损伤的因素及对这种损伤的保护，就成了近年来EC研究的一个重点，而建立理想的EC体外培养方法是此研究的关键所在。

目前，内皮细胞取自人脐静脉或家兔、小牛、大鼠的主动脉、小牛肾上腺毛细血管、大鼠脑毛细管等，但以人脐静脉内皮细胞为最好。分离血管内皮细胞方法有酶消化法、贴块培养法、机械剥脱法及微载体法，以酶消化法应用较多。将分离的内皮细胞置于适宜的培养液中进行培养，以内皮细胞损伤剂造成细胞损伤。损伤剂可用多聚阳离子（多聚赖氨酸）、氧自由基（黄嘌呤+黄嘌呤氧化酶）。观察指标有形态学、PGI2含量测定，乳酸脱氢酶活性测定、³H-TdR掺入等，以检测药物抗损伤作用。

【材料】

1．人脐带（约15cm长，4℃无菌保存，分娩12小时内使用）。

2．试剂胰蛋白酶、小牛血清、培养基（DMEM培养粉或RPMI 1640, M199等）。损伤试剂、指标试剂、6-酮-PGF1试剂盒、3H-TdR, D-Hanks液（每l000ml含NaCl 8.00g, KCl 0.40g,NaH₂P0₄·H₂0 0.06g, NaHC0₃ 0.35g,酚磺酞0.02g)、PBS（每l000ml含NaCl 18g, KCl 0.2g, Na₂HPO₄·12H₂0 2.86g, KH₂P0₄ 0.2g) , Hanks液（在D-Hanks液加MgS0₄·7H₂0 0.20g, CaCl₂（无水）0.14g、葡萄糖l.00g)。

3．仪器及试剂净化工作台、C0₂孵箱、倒置显微镜、荧光显微镜、液体闪烁计数仪、分光光度计。

【方法】

1．内皮细胞的培养 以人脐静脉内皮细胞、酶消化法、原代内皮细胞培养为例的方法介绍如下。实验操作应完全在无菌条件下进行。取正常分娩脐带，用75％乙醇棉球擦去脐带外表血污，剪去两端曾被夹钳过的部分。找出脐静脉，将两端插入玻璃套管并固定，用注射器抽取D-Hanks液冲洗静脉2～3次，将管腔内的残血冲洗干净。一端用止血钳夹紧，从套管另一端灌入0.25%胰蛋白酶液，使脐静脉管腔充盈，用止血钳同法夹紧后置37℃温箱孵育消化20分钟左右。取出脐带，用消毒纱布轻轻地挤压血管，使内皮细胞脱落。收集消化液于离心管内，再用含有20％小牛血清的培养液冲洗脐静脉内腔2～3次，将冲洗液一并收集于离心管中，以1000r/min离心10分钟。倾去上清液，加入培养液（内含20％小牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100ug/ml)吹打数次，制成细胞悬液，9滴该悬液加1滴0.4％锥虫蓝染液，混匀后静置2～3分钟，用细胞计数板在倒置相差显微镜下观察，不被染色而透亮者为活细胞，并计算活细胞百分率。按（3～5)x10⁴/ml密度接种于培养瓶或培养板中，置37℃,5% C0₂,95% O₂的孵箱中培养，24小时后倾去含细胞碎屑和未贴壁细胞的培养液，换入新鲜培养液，以后每2天换液一次。一般4～7天左右细胞生长融合，呈铺路石样镶嵌式单层排列，即可用酶液消化法进行传代。

传代时用0.05％胰蛋白酶-02% EDTA适量（浸过培养瓶底部即可），在室温中消化细胞约5分钟，此时细胞逐渐脱壁，倒置相差显微镜下观察细胞颜色加深，由原来的融合状态变成轮廓清晰的单个细胞。轻轻倒去酶液，以Hanks液清洗一次，加入适量培养液，用玻璃吸管向培养瓶底部均匀吹打（注意瓶角部位亦应吹打），使细胞脱落并制成细胞悬液，按前述方法离心，以洗去残留酶液，沉淀中加入培养液再次吹打成细胞悬液，细胞计数及种植密度均与前述方法相同。通常按1:1传代后实验。

2．实验设计在消化后制成细胞悬液时，即可把细胞直接接种在96孔或24孔板中培养。待细胞融合，即可实验。通常把细胞孔分成正常组（不加药和损伤剂）；损伤组（不加药只加损伤剂）和若于给药组（加不同剂量药物，加损伤剂）。给药组细胞首先给含药培养液，培养数小时（一般6～24小时），使药物与细胞充分作用，然后吸去上清含药液，并用Hanks液轻轻冲洗几次，洗去全部药液。加损伤剂如：①多聚阳离子损伤剂：加入含多聚赖氨酸培养液200ul终浓度200nmol/L，在37℃孵育2小时，观察结果；②氧自由基损伤剂：黄嘌呤(X）和黄嘌呤氧化酶(XO）培养液200 u1，终浓度分别为10umol/L,200umol/L，在37℃孵育16小时，即可观察结果。

【结果与分析】

1．内皮细胞鉴定主要以前两种方法鉴定。

(1)内皮细胞形态观察：以倒置相差显微镜常规观察内皮细胞的生长特征。正常生长的内皮细胞呈梭形或多角形，镶嵌排列成铺路石状，相互融合，单层致密排列。损伤组细胞形态细长如柳叶，大小不匀，分布不均，间隙很大。也可以每一视野细胞计数进行定量比较。

(2）因子Ⅷ间接免疫荧光检测：此法为内皮细胞特异鉴定法。将培养在盖玻片上的内皮细胞及对照组血管平滑肌细胞用95％乙醇，5%醋酸固定15分钟后滴加入第珊因子相关抗原诊断血清（原液1:4稀释），于37℃孵育1小时，或4℃过夜。PBS冲洗并吸干后加异硫氢酸荧光素FITC标记的羊抗兔IgG血清（原液1:20稀释），于37℃孵育30分钟。PBS冲洗并吸干后滴加9:1的纯甘油-PBS封片。用荧光显微镜检查，光源为HB0200，激光片为BG17,滤光片为630nm。内皮细胞在荧光显微镜下见细胞核周出现细长的荧光颗粒，为阳性反应。而平滑肌细胞无此荧光颗粒，为阴性反应。

(3) Weibel-Palade小体：该小体是血管内皮细胞又一特异性的标志。上述的第Ⅷ因子相关抗原就是该小体产生的。以2.5％戊二醛原位固定生长呈融合状的内皮细胞30分钟。电子显微镜下，呈现0.1～0.3 um，长0.5～5 um的椭圆形棒状结构。Weibel-Palade小体虽为内皮细胞的特异结构，但由于电镜标本的制作部位不同，非每个细胞都能检出，故不作为内皮细胞的常规鉴定方法。

2. 3H-TdR掺入测定内皮细胞被损伤剂损伤2小时后，吸去上清液，加入含3H-TdR培养液（3.7x10⁴Bq/孔，终体积200ul），在37℃孵育24小时后终止，每孔用冷PBS 200ul清洗3次，然后加入4℃的10％三氯醋酸200ul，放入4℃冰箱30分钟后取出，吸去三氯醋酸，加入乙醚：乙醇(1:2）混合液200ul漂洗，吸去液体，晾干。加入0.4mol/L NaOH溶液200 ul/孔溶解细胞，在56℃恒温箱中放置2小时，吸出全部液体，注入含5 ml闪烁液的闪烁瓶中，加盖、摇匀，放置2小时后以液闪计数仪测定。设正常组为100%，计算各组³H-TdR掺入率。损伤越重，DNA合成减少，³H-TdR掺入率越低。

3．细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH）测定细胞损伤可使内含物渗出到培养液中，随损伤加重，渗出物增多。

(1)实验前应先按表11-2的方法制作标准曲线。

充分混匀后置37℃水浴中15分钟。然后各管加入4mo1/L的NaOH 10m1，混匀后置室温中静置15分钟。在721分光光度计中以440nm波长比色，以蒸馏水校正吸收值（A）到0点，读出各管A，减去0号管读数后与其相应单位值（1～10号管依次为250,750,1000,1250,1500,1750,2000,2250,2500U/ml）在坐标纸上作图，绘制标准曲线。

(2）实验组细胞培养液中乳酸脱氢酶测定方法为：每孔细胞均设测定管，对照管各1,每管加入细胞培养的上清液0.05 ml，乳酸钠缓冲液0.5ml,混匀后于37℃水浴中放置3分钟，然后测定管加入辅酶I 0.1 ml (5 mg/ml )，对照管加蒸馏水0.l ml。充分混匀后在37℃水浴中置15分钟，再于各管中各加入2,4-二硝基苯肼溶液0.5 ml，混匀后再次放入37℃水浴中放置15分钟。取出试管后各加入0.4mo1/L NaOH 5.Oml终止反应。混匀后在室温下静置5分钟。在721分光光度计以440nm波长处比色，以蒸馏水校正A到0(零）点，读出各管A，算出测定管与对照管A差值，在标准曲线上查出LDH活力单位。细胞损伤越重，酶活力越高。

4. 6-酮-PGF1a放射免疫测定 血管内皮细胞能产生前列腺素（prostacyclins, PG12)，测定PGI2稳定代谢产物6-酮-PGF1a的含量是测定内皮功能常用方法。取待测细胞培养上清液0. 05 ml，以吲哚美辛终止反应，用1 mol/L HCl调pH至3.0～4.0，加重蒸馏醋酸乙酯5 ml提取样品，重复操作1次，每次以3000r/min, 4℃离心15分钟，将两次提取的上清液合并。用负压抽干或吹干。抽干或吹干样品密封于-20℃保存。测定前从-20℃取出样品，放置室温15～20分钟后，加PBS 1 ml混匀，按药盒说明测定6-酮-PGF1a，并进行计算。

【注意事项】

1．内皮细胞的鉴别血管内皮细胞易与平滑肌细胞、纤维细胞相混，实验中必须进行鉴定。方法有形态鉴定及因子皿相关抗原间接免疫荧光检测。内皮细胞在光镜下观察，在融合状态时呈致密的单层铺路石状镶嵌排列，细胞为梭形或多角形。胞质内第姗因子相关抗原免疫荧光染色，在荧光显微镜下观察呈黄绿色。

2．从血管内膜取内皮细胞方法甚多，酶消化法分离出来的细胞纯度高，方法也不难，但可损伤细胞膜表面生化活性，甚至损伤细胞，关键在于掌握消化时间。传代时酶作用时间长短以镜下观察细胞形态为准，将要脱壁时即停止消化。人脐静脉内皮细胞传代培养较难，一般只能传2～3代，以后细胞会陆续死亡且脱落。国外报道在原代培养的培养瓶底部铺上一层0.5％明胶，并同时在培养液中加入内皮细胞生长因子（ECGF 67mg/L)，可传至10代以上。

3．无菌操作是细胞培养成功的必备条件。培养液中小牛血清质量是细胞生长良好与否的重要因素。pH必须保持在7.2～7.4之间。

4．试剂与细胞孵育时间损伤剂与细胞接触时间和保护性药品与细胞孵育时间应根据药品及损伤剂性质决定。