(一)适用范围

食品、饲料、种子及其环境材料中转基因大豆GTS-40-3-2成分的实时荧光PCR定量检测。

(二)实验原理

采用实时荧光定量PCR技术和可特异性扩增转基因大豆GTS-40-3-2中结构基因或品系特异性基因以及入豆Lectin的引物和两端标记荧光的探针，分别扩增测试样品DNA,并实时监测PCR产物。与此同时，用相同的引物、探针和条件扩增已知浓度的阳性标准物质(或阳性标准分子)，以获得稳定的标准曲线，根据外源基因(结构特异性基因或品系性特异基因)和内源基因的标准曲线可分别计算出样品中对应基因的绝对含量(拷贝数或浓度)，并由绝对含量计算转基因大豆GTS-40-3-2在测试样品中的相对含量。如采用阳性标准分子时计算相对含量应使用转换系数。

(三)检测

1．结构特异性基因检测

检测转基因大豆GTS-40-3-2结构特异性基因(CTP与CP4 EPSPS边界序列)和大豆内源Lectin基因。

相对定量检测低限：0.1%。

(1)主要试剂

①引物和探针：以转基因大豆GTS-40-3-2结构特异性基因及大豆内源Lectin基因所用引物序列和探针序列如表5-10所示。

表5-10检测转基因大豆GTS-40-3-2结构 特异性基因的引物序列和探针序列

注：FAM : 6-carboxyfluorescein, TAMRA ; 6-carboxytetramethylrhodamine；结构特异性基因扩增片段长度为74bp, Lectin扩增片段长度为74bp。

②反应体系：实时荧光定量PCR反应体系如表5-11所示。

表5-11实时荧光定量PCR反应体系

注：ROX=carboxy-X-rhodmine;a TagMan Universal Master Mix是由ABI公司提供的产品商品名，此处亦可使用其他具有相同效果的产品。

(2)反应参数检测转基因大豆GTS-40-3-2中结构特异性基因的实时荧光定量PCR反应参数如表5-12所示。

表5-12实时荧光定量PCR反应参数

(3)计算结果根据转基因大豆GTS-40-3- 2结构特异性基因的绝对含量，可按下式计算其在测试样品中的相对含量：

2．品系特异性基因检测

检测转基因大豆GTS-40-3-2品系特异性基因(大豆基因组DNA与GTS-40-3-2品系特异基因之间的边界序列)和大豆内源Lectin基因。

绝对定量检测低限：40～100个拷贝。

(1)主要试剂

①引物和探针：检测转基因大豆GTS-40-3-2品系特异性基因及大豆内源Lectin基因的引物序列和探针序列如表5-13所示。

表5-13检测GTS-40-3-2品系特异性基因的引物序列和探针序列

注：FAM ; 6-carboxyfluorescein, TAMRA ; 6-carboxytetramethylrhodamine；品系特异性基因扩增片段长度为85bp. Lectin扩增片段长度为74bp。

②反应体系：实时荧光定量PCR反应体系如表5-14所示。

表5-14实时荧光定量PCR反应体系

注：ROX=carboxy-X-rhodmine;a TagMan Universal Master Mix是由ABI公司提供的产品商品名，此处亦可使用其他具有相同效果的产品。

(2)反应参数实时荧光定量PCR反应参数如表5-15所示。

表5-15实时荧光定量PCR反应参数

(3)计算结果根据转基因大豆GTS-40-3-2品系特异性基因的绝对含量，可按下式计算其在测试样品中的相对含量：

相关链接：PCR方法对转基因大豆的筛选定性检测

文章来源：《食品质量与安全检测技术》

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