5 仪器

5.1 气相色谱-质谱仪：配有负化学源。

5.2 离心管：5mL和10mL，具塞。

5.3 移液器：20 uL～200 uL,200 uL～1000 uL, 1000uL～5000uL。

5.4 分析天平：感量0.1mg和0.01g。

5.5 冷冻离心机：最低温度-4℃，最大转速10000r/min。

5.6 涡旋混匀器。

5.7 氮气浓缩仪。

5.8 水平振荡器。

5.9 旋转蒸发仪。

5.10 旋涡振荡器。

6 试样制备与保存

6.1 试样的制备

6.1.1 牛奶：取有代表性试样约500 g，搅拌均匀后装入洁净容器内，密封，并做好标识。

6.1.2 奶粉：取有代表性试样约500 g，搅拌均匀后装入洁净容器内，密封，并做好标识。准确称取12g乳粉试样(精确到0.01g)于250 mL烧杯中，少量多次加入50 mL煮沸并冷却到60℃左右的水溶解，冷却至室温后，移入100 mL容量瓶中，用少量水分次淋洗烧杯，淋洗液一并移入容量瓶，再用水定容到刻度，混匀，制备成奶粉复原乳试样。

6.2 试样的保存

将试样于4℃保存。

7 测定步骤

7.1 提取

准确移取2.0g牛奶或量取2.0 mL奶粉复原乳试样(6.1.2)置于50mL具塞离心管中万加入5 mL乙酸钠缓冲溶液(4.14)、约1g氯化钠(4.12)，旋涡振荡1 min后，加入10 mL乙腈(4.3)，充分旋涡混合1 min，于水平振荡器上(5.8)剧烈振荡2 min，超声提取10 min, 7000r/min于4℃离心10 min，用谧吸管将上清液移入另一离心管。残渣中加入10 mL乙腈，按上述方法再提取一次，合并上清液。

上清液中加入10 mL正己烷(4.5)，剧烈振荡2 min, 7000 r/min于4℃离心5 min，吸正己烷，弃去下层溶液转移至梨形瓶，加入0.5 mL正丙醇(4.8)于40℃水浴旋转蒸发(约剩余1 mL左右不能完全蒸干)。加入1 mL乙腈，旋涡振荡1min，转移至10 mL离心管，再用1 mL乙腈清洗瓶一次，溶液转移至上述离心管后，用纯水定容到10 mL。

7.2 净化

将提取液(7.1)移入下接Oasis HLB柱(4.18)的贮液器中，溶液以不大于1 mL/min的流速通过Oasis HLB柱，待溶液完全流出后，用3 mL纯水洗柱，弃去全部淋出液，抽干。最后用9 mL乙腈洗脱，收集洗脱液于10 mL具塞离心管(5.2)中，用氮气浓缩仪(5.7)吹干。

7.3 衍生化

在上述10 mL具塞离心管中依次加入85 uL干燥的乙酸乙酯(4.15)，500uL乙酸乙酯-吡啶(4.16),20 uL五氟苯甲酰氯(4.9)，混匀，于60℃放置15 min后，用氮气浓缩仪吹干。加入500uL0.5mol/L碳酸氢钠溶液(4.17),涡旋振荡，待溶液澄清后，准确加入1 mL异辛烷，混合提取，静置，取上清液进行测定。

7.4 测定条件

7.4.1 气相色谱-质谱测定参考条件

a)色谱柱：HP-5MS,0.25 um ,30 m×0.25 mm(内径)或相当者；

b)载气：氦气，纯度≥99.999%；

c)流速：初始流速1.0mL/min;保持5 min，然后以1.0 mL/min速度升至3 mL/min;

d)柱温;120℃保持2 min，然后以15℃/min升温至250℃，再以5r/min升攀至300℃保持8 min；

e)进样量：1 uL;

f)进样方式：无分流进样；

9)进样口温度：300℃；

h)接口温度：280℃;

i)负化学源：150 eV;

J)离子源温度：150℃；

k)四极杆温度，106℃；

1)反应气：甲烷，纯度≥99.99％;

m)反应气流量：2 mL/min;

n)选择离子监测：监测离子、丰度比、允许相对偏差见表1。

表1 监测离子、丰度比、允许相对偏差

7.4.2 定性测定的依据

被测样品色谱峰的保留时间与标准工作溶液相一致；所选择的离子均出现，被测样品的监测离子的相对丰度与标准工作溶液的相对丰度两者之差不大于表1中所列允许相对偏差。

7.4.3 定量测定

配制系列标准工作溶液(4.23)分别进样，仪器测定β-雌二醇以m/z 660为定量离子，内标β-雌二醇D4以m/z 664为定量离子，以峰面积比对浓度绘制标准工作曲线，用标准工作曲线内标法对样品进行定量，样品溶液中待测物质的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件下，β-雌二醇衍生物参考保留时间约为26 min。

相关链接：牛奶和奶粉中β-雌二醇残留量的测定（一）

文章来源：《常用兽药残留量检测方法》

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