7 测定步骤

7.1 提取

称取10 g试样(精确到0.01g)置于50mL具塞玻璃离心管中，加入10 mL水，在液体混匀器上混匀，加20 mL乙酸乙酯，于振荡器上振荡20 min，以3000r/min离心5 min，取上清液过盛有25 g无水硫酸钠筒形漏斗至梨形瓶中。再用20 mL乙酸乙酯提取一次，过无水硫酸钠筒形漏斗，合并上清液，用旋转蒸发器于45℃水浴上减压蒸发至约2 mL，待净化。

7.2 净化

将上述浓缩液移至Carboxylic Acid固相萃取柱中，再分别用4 mL乙酸乙酯和4 mL乙腈洗涤梨形瓶和萃取柱，弃去全部流出液。在65kPa的负压下，减压抽干萃取柱2 min，用2 mL洗脱剂以≤3 mL/min流速洗脱，收集洗脱液于5 mL刻度样品管中，用洗脱剂定容至2 mL，过0.20um滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。

7.3 测定

7.3.1 液相色谱条件

a)色谱柱：Atlantis dC₁₈, 3um,150 mm×2.1mm(内径)或相当者；

b)流动相：乙腈+0.1％甲酸水((30+70);

c)流速：200 uL/min;

d)柱温：30℃；

e)进样量：20uL。

7.3.2 质谱条件

a)离子源：电喷雾离子源(ESI)；

b)扫描方式：正离子扫描；

c)检测方式：多反应监测；

d)电喷雾电压：5500 V;

e)雾化气压力：0.069 MPa;

f)气帘气压力：0.069 MPa;

g)辅助气流速：6L /min:

h)离子源温度：700℃；

i)定性离子对，定量离子对，去簇电压和碰撞能量见表1。

表1 三种硝基咪唑药物的质谱参数

7.3.3 液相色谱-串联质谱测定

在仪器最佳工作条件下，用甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝咪唑混合基质标准工作溶液分别进样，以峰面积为纵坐标，混合基质标准工作溶液浓度为横坐标绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝咪唑的响应值均应在仪器测定的线性范围内。

表2 三种硝基咪唑药物的参考保留时间

7.4 平行试验

按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。

7.5 空白试验

除不称取试样外，均按上述步骤同时完成空白试验。

8 结果计算

结果按式(1)计算：

式中：

X—试样中被测组分残留量，单位为微克每千克(ug/kg) ;

c—从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL) ;

V—样品溶液最终定容体积，单位为毫升(mL);

m—样品溶液所代表最终试样的质量，单位为克(g)。

注：计算结果应扣除空白值。

9 精密度

本标准的精密度数据是按照GB/T 6379.1和GB/T 6379.2的规定确定的，重复性和再现性的值以95％的可信度来计算。

9.1 重复性

在重复性测定条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r。蜂蜜中甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝咪唑含量范围及重复性方程见表3。

表3 含量范围及重复性和再现性方程

如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。

9.2 再现性

在再现性测定条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R。蜂蜜中甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝咪唑的含量范围及再现性方程见表3。

文章来源：《常用兽药残留量检测方法》

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