7.5 确证

7.5.1 液相色谱-串联质谱条件

a)色谱柱：Atlantis HILIC Silica 3 um,150 mm×2.1mm(内径)或相当者；

b)流动相：乙腈-0.1％甲酸溶液(4.10)(17+8);

c)柱温：30℃；

d)进样量：10 uL;

e)流速：200uL/min；

f)离子源：电喷雾源ESI，正离子模式；

g)扫描方式：多反应监测(MRM);

h)离子源温度：500℃；

i)雾化气、气帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气及其他合适气体；使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求；

j)仪器工作所需电压值应优化至最优灵敏度；

k)定性离子对、定量离子对、碰撞池出口电压和碰撞气能量见表1。

表1 定性离子对、定量离子对、碰撞池出口电压和碰撞气能量

7.5.2 液相色谱-串联质谱确证

将基质标准工作液和7.2中所得滤液(必要时用乙腈稀释至适当浓度)用LC-MS/MS测定。如果样液中与标准工作液相同的保留时间有检测离子峰出现，则对其进行质谱确证。

7.5.3 定性标准

7.5.3.1 保留时间

待测样品中化合物色谱峰的保留时间与标准溶液相比变化范围应在±2.5％之内。

7.5.3.2 信噪比

待测化合物的定性离子的重构离子色谱峰的信噪比应大于等于3(S/N≥3)。

7.5.3.3 定量离子、定性离子及子离子丰度比

每种化合物的质谱定性离子必须出现，至少应包括一个母离子和两个子离子，而且同一检测批次，对同一化合物，样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比，其允许偏差不超过表2规定的范围。

表2 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差

7.6 平行试验

按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。

7.7 回收率试验

在阴性样品中添加适量标准溶液，按7.1和7.2操作，测定后计算样品添加的回收率。

8 结果计算

用数据处理软件中的外标法，或绘制标准曲线，按式(1)计算试样中河豚毒素含量：

式中：

X—试样中河豚毒素含量的数值，单位为微克每千克(ug/kg) ;

c—由标准曲线而得的样液中河豚毒素含量的数值，单位为微克每升(ug/L) ;

c_o—由标准曲线而得的空白实验中河豚毒素含量的数值，单位为微克每升(ug/L) ;

V—样品最终定容体积，单位为毫升(mL);

m—最终样液代表的试样量，单位为克(g)。

计算结果应扣除空白值。

9 精密度

9.1 一般规定

本标准的精密度数据是按照GB/T 6379.1和GB/T 6379.2的规定确定的，重复性和再现性的值以95％的可信度来计算的。

9.2 重复性

在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限(r)，被测物的添加浓度范围及重复性方程见表3。

表3 河豚毒素的添加浓度范围及重复性和再现性方程

如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。

9.3 再现性

在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限(R)，被测物的添加浓度范围及再现性方程见表3。

文章来源：《常用兽药残留量检测方法》

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