5 仪器

5.1 液相色谱仪，带有荧光检测器与柱后衍生装置。

5.2 液相色谱-串联四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源。

5.3 分析天平：感量0.1mg和0.01g。

5.4 组织捣碎机。

5.5 旋涡振荡器。

5.6 超声波发生器。

5.7 减压浓缩装置。

5.8 固相萃取装置。

5.9 真空泵：真空度应达到80 kPa。

5.10 微量注射器：1 mL～5mL,100uL～1000uL。

5.11 离心机：转速达4000r/min。

5.12 离心机：转速达13000r/min，配有酶标转子。

5.13 冷冻高速离心机：转速达到18000r/min，可致冷4℃。

5.14 K-D浓缩瓶：100 mL与25 mL。

6 试样的制备与保存

制样操作过程中应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。由于河豚毒素为剧毒物质，对于可能含有河豚毒素的产品，应避免直接接触或误食，相关的器皿和器具可以采用4％碳酸钠溶液浸泡加热去毒处理。

6.1 试样制备

从所取全部样品中取出有代表性样品的可食部分约500 g，切成小块，放入组织捣碎机均质，充分混匀，装入清洁容器内，并标明标记。

6.2 试样保存

试样于-18℃以下保存，新鲜或冷冻的组织样品可在2℃～6℃贮存72 h。

7 测定步骤

7.1 提取

称取5.00 g匀浆样品置于50 mL聚丙烯离心管中，加入20 mL 1％乙酸甲醇溶液(4.7)，旋涡振荡2 min, 50℃水浴超声提取20 min, 4000r/min离心5 min，取上清液，在残渣中再加入20mL 1％乙酸甲醇溶液，重复以上步骤，合并上清液，过滤至100 mL K-D浓缩瓶中，60℃旋转蒸发浓缩至近干，加入2 mL 1％乙酸溶液(4.8)，振荡洗涤浓缩瓶，转移至10 mL聚丙烯离心管中，4℃下于18000r/min离心10 min，取上清液待净化。

7.2 净化

将7.1所得的澄清溶液以约1 mL/min的流速过柱，用10mL 1％乙酸溶液(4.8)洗脱，合并流出液与洗脱液，置于25 mL K-D浓缩瓶中，于60℃下减压浓缩至近干，用1％ 乙酸溶液(4.8)定容1 mL，过0.2 um滤膜，供液相色谱分析。进行液相色谱-串联质谱确证时，将样液装入离心超滤管中，13000r/min离心15 min，取滤液测定。

7.3 空白基质溶液的制备

称取阴性样品5.00g，按7.1和7.2操作。

7.4 测定条件

7.4.1 液相色谱参考条件

a)色谱柱：Purospher Star PR-18e C₁₈柱，5 um, 250 mm×4.6 mm(内径)或相当者；

b)柱温：30℃；

c)流动相：乙腈-乙酸铵缓冲液(4.9)(1+19)；

d)流速：1.0 mL/ min;

e)激发波长：385 nm，发射波长：505 nm;

f)进样量：40.0uL。

7.4.2 柱后衍生参考条件

a)衍生溶液：4 mol/L氢氧化钠溶液(4.11);

b)衍生溶液流速：0.5mL/min;

c)衍生管温度：110℃。

7.4.3 色谱测定

根据试样中被测物的含量情况，选取响应值适宜的标准工作液进行色谱分析。标准工作液和待测样液中河豚毒素的响应值应在仪器线性响应范围内。标准工作液与待测样液等体积进样。在上述色谱条件下，河豚毒素的参考保留时间为10.3min，根据标准溶液色谱峰的保留时间和峰面积，对样液的色谱峰进行定性并外标法定量。

相关链接：水产品中河豚毒素的测定（一）

文章来源：《常用兽药残留量检测方法》

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