5 试剂

除另有规定外，所使用的试剂为分析纯或生化纯试剂，水为按照GB/T 6682规定的一级水。5.1中等相对分子质量蛋白质标准的组成：Rabbit phosphorylase B 97 400 Dalton、Bovine Serum Al-bumin 66 200 Dalton、Ovalbumin 42 700 Dalton、Carbonic Anhydrase 31 000 Dalton、Trypsin Inhibitor20 100 Dalton、Lysozyme 14 400 Dalton)开封后溶于200 uL的双蒸水，分装于20个小管内(每管10 uL)，于沸水中加热5min后，保存于-20℃。使用前于室温融化，加DTT至100 mmol/L，于沸水中加热5 min后上样。如果用银染检测蛋白，应用1×的上样缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl, pH6.8,10％甘油，2%SDS，0.05％溴酚蓝，100 mmol/L DTT)稀释50倍后再上样。

5.2 A液100 mL:29.2g丙烯酰胺，0.8gN,N-甲叉双丙烯酰胺，加去离子水定容至100 mL。

5.3 B液100 mL:75 mL 2 mol/L Tris-HCl(pH8.8), 4 mL 10%SDS, 21 mL加去离子水。

5.4 C液100 mL:50 mL 1 mol/L Tris-HCl(pH6.8), 4 mL 10% SDS, 46 mL加去离子水。

5.5 5倍样品缓冲液：0.6 mL 1 mol/L Tris-HC1(PH=6.8), 5 mL 50％甘油。2 mL 10％ SDS.0.5 mL 2-巯基乙醇,1 mL 1％嗅酚蓝，0.9 mL去离子水。

5.610％ SDS十二烷基磺酸钠)。

5.710％ 过硫酸铵(AP)。

5.8 TEMED(四甲基乙二胺)。

5.9 染色固定液：取50％甲醇454 mL，冰乙酸46 mL混匀。

5.10 染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液250 mL，过滤后备用。

5.11 脱色液：冰乙酸75 mL，甲醇50 mL，加蒸馏水定容至1 000 mL。

5.12 电泳缓冲液(内含0.1％ SDS, 0.05) mol/L Tris-0.384 mol/L 甘氨酸缓冲液pH8.3)：称Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加入SDS 1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000mL，pH8.3。

5.13 10 mL、离心管和1.5 mL。

5.14 0.5 mol/L Tris-HCI缓冲液：称取60.6g Tris Base，加蒸馏水定容至1000mL，用HCI调节至pH 6.8。

5.15 底物缓冲液：0.3 mol/L乳酸锂。二乙醇胺2.1g，乳酸锂2.9g,调pH值至8.8，用水定容至100 mL。

5.16 11.3 mol/L NAD溶液：NAD 15 mg，用水定容至2 mL, 4℃保存至少可用2周。

5.17 1 mmol/L 2.4-二硝基苯腆溶液：2,4-二硝基苯腆198 mg，加10 mol/L HCI 100 mL，待溶解后加蒸馏水定容至1 000 mL，置棕色玻璃瓶中保存。

5.18 0.4 mmol/L氢氧化钠溶液：氢氧化钠1.6g定容至100 mL。

5.19 0.5 mmol/L丙酮酸标准液：丙酮酸钠11 mg，以底物缓冲液溶解后定容至200 mL容量瓶，临用前配制。

5.20 LDH标准品。

6 仪器设备

6.1 垂直电泳系统。

6.2 水浴锅。

6.3 离心机。

6.4 笔式温度传感器。

6.5 高速匀浆机。

6.6 水浴锅。

6.7 脱色摇床。

6.8 组织粉碎机。

6.9 天平(精确到0.001g)。

6.10 均质器。

6.11 离心机。

6.12 水浴锅。

6.13 探针式温度计。

6.14 酶标仪。

6.15 温育培养箱(5℃～60℃)。

6.16 单道微量加样器：50 uL,100uL,20uL～200uL可调，200uL～1000uL可调。

6.17 多通道微量加样器：50uL～250uL可调。

7 检测方法

7.1 SDS-PAGE电泳检测方法

7.1.1 制样

称取样品的肌肉或内脏的内部组织10g，分两份。每份5g，其中一份室温放置，命名样品C(con-trol)；一份在恒温水浴加热，如果报检样品有加热温度和加热时间的检测要求则按照样品报检要求检测，如果报检样品只要求检测样品是否热变性，则按照热加工温度75℃ 1min的要求来检测。样品中心放置温度计。待样品中心温度达到报检温度时开始计时，再加热报检规定的加热时间，命名为H(heat)。样品C、样品H各加入4℃预冷的0.5 mol/L Tris-HCl缓冲液20 mL。匀浆10 s,8000r/min离心20 min。各取100uL上清液放入4℃等待上样。

7.1.2 SDS-PAGE电泳

7.1.2.1 配制聚丙烯酰胺凝胶

配制分离胶浓度为10％，厚度为1.5mm，配制10 mL,需A液3.3 mL, B液2.5 mL，去离子水4.8 mL,10％过硫酸钱100uL TEMED 10uL。按照电泳槽说明书组装凝胶模具，用吸管吸取分离胶溶液，沿隔板缓慢加入模具内，小心避免产生气泡，当加入的溶液至前玻璃板1.5 mL时即可，轻轻在分离胶溶液上覆盖一层1 min～5 mm的水层，这使凝胶表面变得平整。等待30 min～60 min，使凝胶聚合。

配制浓缩胶浓度为5％，配制4 mL，需A液0.67 mL,C液1.0 mL，去离子水2.3 mL，10％过硫酸铵30uL, TEMED 5 uL。轻轻吸去水层，用吸管吸取堆积胶溶液缓慢加入，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端，插入梳子，约30 min凝胶聚合，小心拔出梳子，将凝胶放入电泳槽内，预先接好电极，将电泳缓冲液加入内外电泳槽中，使凝胶的上下端均能浸泡在缓冲液中。

注：也可以使用相同浓度的聚丙烯酰胺预制胶产品。

7.1.2.2 制备样品和上样

取20 uL样品与5uL 5×样品缓冲液在一个Eppendorf管中混合，离心10 s，用微量注射器吸取样品20 uL加入样品孔底部。

7.1.2.3 电泳

打开电泳仪，将电压调至200V，恒压大约30 min，当溴酚蓝达到凝胶底部，关闭电源。

7.1.2.4 染色

戴手套将凝胶放入盛有100 mL染色固定液的容器中，在摇床上振荡30 min，加入考马斯亮蓝染液200 mL染色1h。弃去染液，将凝胶在水中漂洗3次，加入脱色液100 mL，振荡1h后观察结果，并照相。也可以使用购买商品化的具有相同效果的染色剂和脱色剂，并按照其说明书操作。

相关链接：动物源性食品中热变性蛋白检测方法（一）

文章来源：《食品化妆品检验卷无机元素和放射元素及其他检测方法》

版权与免责声明：转载目的在于传递更多信息。

如其他媒体、网站或个人从本网下载使用，必须保留本网注明的"稿件来源"，并自负版权等法律责任。

如涉及作品内容、版权等问题，请在作品发表之日起两周内与本网联系，否则视为放弃相关权利。