4.5 检验步骤

4.5.1 样品制备

按四分法将原始样本分出试验样本、复检样本和保留样本。进一步按四分法将试验样本缩分至约25g。从缩分的试验样本中随机挑选42粒完整的米粒，从每个米粒中提取DNA。

4.5.2 样品DNA提取

将米粒粉碎，放入微量离心管中，加入600 uL裂解液，65℃ 2h，期间不时振荡混匀；12000g离心5 min，转移上清液于洁净离心管中，加等体积酚，混匀；12000g离心5 min，转移上清液(300uL)于洁净离心管中，加等体积三氯甲烷＋异戊醇(24+1)，混匀；12000g离心5 min，取上清液(150uL)；加2.5倍体积冷乙醇，-20℃沉淀过夜：12000g离心5min，弃上清液；70％乙醇洗涤一次，晾干；加入100 uL水，溶解沉淀。

也可用等效DNA提取试剂盒提取模板DNA。

4.5.3DNA浓度和纯度的测定

取5uL DNA溶液加ddH2O稀释至1 mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260 nm和280 nm处的吸光值。当A260/A280比值在1.7～1.9之间时，适宜于PCR扩增。

4.5.4 RAPD扩增

按表1配制RI2反应体系。

表1 RI2反应体系

反应程序：94℃预变性5 min，94℃变性1 min, 37℃退火1 min, 72℃延伸2 min, 45个循环。72℃延伸5 min。4℃保存。

检测过程中设置巴吞米阳性对照、KDML 105阴性对照和空白对照。

4.5.5 普通PCR扩增

按表2配制RI5反应体系。

表2 RI5反应体系

反应程序：94℃预变性5 min, 94℃变性45s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s，35个循环。72℃延伸5 min。 4℃保存。

检测过程中设置除泰国香米和巴吞米以外的大米品种阳性对照、KDML 105阴性对照和空白对照。

4.5.6 PCR扩增产物电泳检测

取1.5 g琼脂糖，于100 mL电泳缓冲液中加热，充分熔化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5 ug/mL，制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。将8uL～10uL PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样。9V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部。紫外检测仪下观察电泳结果记录。

4.6 结果判断与表述

4.6.1 对照样品结果特征

4.6.1.1 R12图谱的特征带为449 bp，表述为RI2-449。

4.6.1.2 RI5图谱的特征带为1 107 bp,表述为RI5-1107。

4.6.1.3 泰国茉莉香米RI2-449阴性且R15-1107阴性。

4.6.1.4 巴吞米RI2-449阳性。

4.6.1.5 其他品种RI5-1107阳性。

4.6.2 结果判断及表述

4.6.2.1 RAPD图谱无条带，判定该米粒DNA提取失败，不计。

4.6.2.2 RI2-449阳性或RI5-1107阳性，判定该米粒非泰国茉莉香米。

4.6.2.3 RI2-449阴性且RI5-1107阴性，判定该米粒为泰国茉莉香米。

按照式(1)计算样品中泰国茉莉香米纯度：

e＝M/N×100％······(1)

式中：

C—泰国茉莉香米纯度，％；

M—泰国茉莉香米米粒数；

N—DNA提取有效的米粒数，不少于36。

双试验求其平均数即为检验结果，双试验结果偏差不超过2.0％，出证结果取小数点后1位。

相关链接：泰国茉莉香米品种鉴定及纯度检验方法（一）

文章来源：《食品化妆品检验卷无机元素和放射元素及其他检测方法》

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