3.4 测定步骤

3.4.1 提取

准确称取5.0g样品于50 mL离心管内，加入1.5 mL 20％的盐酸羟胺水溶液、2.5 mL 1.0 mol/L的对-甲苯磺酸溶液、5.0 mL乙酸盐缓冲溶液，用均质机以15 000 r/min的速度均质30 s，加入10 mL乙腈后剧烈震摇30 S再加入10g酸性氧化铝，再次震荡30 s。将离心管置于离心机内以3 000 r/min的速度离心10 min。把上清液转移至装有10 mL水和2 mL 二甘醇的100 mL 离心管中。然后在50 mL 离心管中加入10 mL乙腈，重复上述操作，将上清液转移至同一100 mL离心管中。

3.4.2 净化

在离心管中加入15 mL 二氯甲烷，振荡10s后，置于离心机内以3 000 r/min的速度离心10 min。用尖嘴移液管将下层溶液转移至100 mL的梨形烧瓶中，再用10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次，合并二氯甲烷层于同一梨形烧瓶中。于45℃旋转蒸发至约1 mL，用5 mL-乙腈溶解残渣。

将PRS固相萃取小柱安装在固相萃取装置上，PRS小柱上端再连接中性氧化铝固相萃取小柱，用5 mL 乙腈活化小柱．把烧瓶中的溶液转移到小柱上，在抽真空情况下过柱，再用乙腈洗涤烧瓶两次，每次2.5 mL，把洗涤液依次通过柱，弃去中性氧化铝小柱。在不抽真空的情况下，依次准确用1 mL 流动相、1 mL流动用和1 mL盐酸烃胺甲醇溶液洗脱PRS柱，把洗脱液收集到5 mL刻度试管中，用流动相稀释至3 mL， 过0.45um微孔滤膜，滤液供液相色谱测定。

3.4.3 标准工作液的配置

根据需要,准确移取适量标准混合液于3 mL刻度试管中，放在40℃加热板上用氮气流吹干，准确加入1 mL盐酸羟胺甲醇溶液，用流动相稀释至3 mL，混匀。

3.4.4 测定

3.4.4.1 液相色谱条件

a)色潜柱：氰基柱，150 mm ×4.6 mm(内径)，填充物粒度10 um，或相当者，在氰基色谱柱和检测器之间连接25％ PbO2氧化柱；

b)流动相：乙腈-乙酸盐缓冲液(55+45);

c)流速：2.0 mL/min;

d)柱温：室温；

e)检测波长：618 nm；

f)进样量：50 uL。

3.4.4.2 色谱测定

根据样液中被测孔雀石绿或隐色孔雀石绿含量情况，选定峰高相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样液中孔雀石绿或隐色孔雀石绿响应值均应在仪器检测线性范围内。对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定。

3.4.5 确证

3.4.5.1 液相色谱-质谱/质谱条件

a)色谱柱：ODS, 250 mm × 2.0 mm，或相当者，在色谱柱和检测器之间连接25％ PbO2氧化柱；

b)流动相：0.05 mol/L 乙酸铵(2H4.5)-乙腈(25+75)；

c)流速：0.2 mL/min；

d)柱温：室温；

e)进样节:50 uL；

f)电离方式：ES+；

g)毛细管电压：2.9 kV；

h)锥体电压：55 V；

i)离子源温度：120℃；

i)干燥温度：350℃；

k)雾化气流量：90L/Hr；

l)干燥气流量:490 L/Hr；

m)碰撞能量.30 eV；

n)测定方式：TOF；

o)母离子(m/z)：329，碎片离子(m/z)：313,208。

3.4.5.2 液相色谱-质谱/质谱确证

对3.4.2和3.4.3中最后所得的样液及标准液，用2 mL 二氯甲烷提取，移取二氯甲烷层并挥干，准确加入1.0 mL 流动相以溶解残渣，按3.4.5.1规定的条件进行测定。如果样液中与标准溶液相同的保留时间有监测离子峰出现，则对其进行质谱确证。

3.4.6 空白试验

除不加试样外，均按上述测定步骤进行。

3.4.7 结果计算和表述

3.4.7.1 结果计算

用色谱数据处理机或按式(1)计算样品中孔雀石绿或隐色孔雀石绿残留含量。

式中：

X—样品中孔雀石绿或隐色孔雀石绿含量，一单位为微克每千克(ug/kg)；

m—孔雀石绿标准工作液或隐色孔雀石绿标准工作液的质量，单位为纳克(ng)；

h—样品中孔雀石绿或隐色孔雀石绿的峰高，单位为毫米(mm)；

H—孔雀石绿标准工作液或隐色孔雀石绿标准工作液的峰高，单位为毫米(mm)；

W—试样量，单位为克(g)。

注：计算结果需扣除空白值。

3.4.7.2 测定结果的表述

本检验方法的残留量测定结果系指孔雀石绿和它的代谢物隐色孔雀石绿残留量的之和，以孔雀石绿表示。

4 测定低限、回收率

4.1 测定低限

本方法中采用HPLC-VIS法孔雀石绿的测定低限为2 ug/kg。

本方法中采用HPLC-MS/MS法孔雀石绿的测定低限为1 ug/kg。

本方法中采用HPLC-VIS法孔雀石绿的测定低限为2 ug/kg。

本方法中采用HPLC-MS/MS法孔雀石绿的测定低限为1 ug/kg。

4.2 回收率

鳗鱼中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿的添加浓度及其回收率的HPLC-VIS实验数据：

在2 ug/kg时，孔雀石绿的回收率为85.5％，隐色孔雀石绿的回收率为87.0％；

在25 ug/kg时，孔雀石绿的回收率为90.0％，隐色孔雀石绿、的回收率为88.0％；

在200 ug/kg时，孔雀石绿的回收率为87.0％，隐色孔雀石绿的回收率为88.5％。

相关链接：进出口水产品中孔雀石绿残留量检验方法（一）

文章来源：《食品化妆品检验卷无机元素和放射元素及其他检测方法》

版权与免责声明：转载目的在于传递更多信息。

如其他媒体、网站或个人从本网下载使用，必须保留本网注明的"稿件来源"，并自负版权等法律责任。

如涉及作品内容、版权等问题，请在作品发表之日起两周内与本网联系，否则视为放弃相关权利。