4.5 测定步骤

4.5.1 样液提取

称取10 g均质好的试样于50 mL离心管中，加入柠檬酸-丙酮缓冲液20 mL，用涡旋振荡器充分振荡3 min，于70℃～75℃水浴保温20 min后，2000g离心15 min取上清液作为样液。

4.5.2 菌悬液的制备

4.5.2.1 藤黄微球菌ATCC9341菌悬液：将复活的菌种接种于盛有增菌用固体培养基的克氏瓶中，30℃培养18h～24 h后，用灭菌生理盐水洗下菌苔，制成菌悬液。置29℃～8℃冰箱保存，贮存期15 d。

4.5.2.2 枯草芽胞杆菌ATCC6633和蜡样芽胞杆菌ATCC11778菌悬液：将复活的菌种分别接种于盛有增菌用固体培养基的克氏瓶中，30℃培养7d，镜检芽胞数达80％以上(如果达不到，可再培养数日，如培养10 d以上，芽胞数仍达不到要求，菌种可能变异，不可使用)，用灭菌生理盐水洗下菌苔，使其悬浮于生理盐水中，65℃水浴加热30 min，经2000g离心20 min，弃去上清液，如此重复洗涤芽胞两次。然后用适量灭菌生理盐水制成菌悬液。置2℃～8℃冰箱保存，贮存期30 d。

4.5.3 检定用平板的制备

4.5.3.1 藤黄微球菌ATCC9341平板

每批菌悬液按下法测定其最适宜用量：把不同浓度藤黄微球菌ATCC9341菌悬液加入AM5培养基中，30℃培养18 h后，使0.025 ug/mL氨苄西林标准工作液可产生14 mm±1 mm清晰、完整的抑菌圈。

无菌吸取1 mL适宜浓度的菌悬液加到100 mL溶化后冷却至50℃左右的灭菌AM5中充分混匀后，取8 mL注入灭菌平皿内，保持水平使其凝固。制备好的平板置2℃～8℃冰箱保存，贮存期2d～3d。

4.5.3.2 枯草芽胞杆菌ATCC6633平板

每批菌悬液按下法测定其最适宜用量：把不同浓度枯草芽胞杆菌ATCC6633菌悬液加入AM5培养基中，30℃培养18 h后，使0.5 ug/mL卡那霉素标准工作液可产生14 mm±1 mm清晰、完整的抑菌圈。

无菌吸取1 mL适宜浓度的菌悬液加到100 mL溶化后冷却至50℃左右的灭菌AM5中充分混匀后，取8 mL注入灭菌平皿内，保持水平使其凝固。制备好的平板置2℃～8℃冰箱保存，贮存期2d～3d。

4.5.3.3 蜡样芽胞杆菌ATM 1778平板

每批菌悬液按下法测定其最适宜用量：把不同浓度蜡样芽胞杆菌ATCC11778菌悬液加入AM8培养基中，30℃培养18 h后，使0.1ug/mL土霉素标准工作液可产生14 mm±1 mm清晰、完整的抑菌圈。

无菌吸取1 mL适宜浓度的菌悬液加到100 mL溶化后冷却至50℃左右的灭菌AM8中充分混匀后，取8 mL注入灭菌平皿内，保持水平使其凝固。所用平板须当天制备。

4.5.4 测定

取制备好的三种检定用平板各两个，在平板底部做好标记，把滤纸片适当间隔置于平板上，每个平板最多不超过6个，用镊子轻压使其固定，在每片滤纸上滴加100 uL样液或标准工作液，冷藏放置30 min后，30℃培养18 h后观察，用游标卡尺测量抑菌圈直径大小。每份样品做两个平板上的平行试验。

4.6 检测结果的判定和报告

如样液在三种平板上均无抑菌圈，标准工作液的抑菌圈达到14 mm±1 mm，即报告“阴性”。

如样液在三种任一平板上呈现抑菌圈，抑菌圈直径在12 mm以上，即报告“初筛阳性”。

如样液在三种任一平板上呈现抑菌圈，抑菌圈直径小于12 mm，大于10 mm视为可疑，必要时重新测试后判定，也可以根据表1中试验菌的敏感性初步判定抗生素种类后，采用其他方法进行确认。

表1 试验菌的敏感性

5 检测限

本方法的检测限为：

—β-内酰胺类；0.05 mg/kg;

—四环素类：0.1 mg/kg;

—大环内酯类：0.05 mg/kg;

—氨基糖苷类：0.5 mg/kg。

相关链接：动物源性食品中抗生素类药物残留检测方法（一）

文章来源：《食品化妆品检验卷无机元素和放射元素及其他检测方法》

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