4.4 测定步骤

4.4.1 样液提取

称取10g均质好的试样于50 mL离心管中，加入pH8.0磷酸盐缓冲液10 mL，用涡旋振荡器充分振荡3 min，于70℃～75℃水浴保温20 min后，2000g离心15 min取上清液作为样液。

4.4.2 菌悬液的制备

在使用前，应确认保存的大肠杆菌ATCC8739生化特性没有改变。测定方法可按SN/T 0169中的鉴定方法进行。一般情况下，菌种的传代次数不应超过5代，否则在每次使用前确证其生化特性没有发生变异，或另需购置新的标准菌株。

在确定保存的菌种生化特性没有改变后，将其接种到增菌用液体培养基中36℃±1℃培养，18 h±2h的培养物作为试验菌悬液。

4.4.3 检定用平板的制备

将试验菌悬液按0.5％的比例加入到溶化后冷却至50℃左右的灭菌检定用培养基中充分混匀后，每块平皿加入4 mL～5 mL混合液，保持水平待其凝固。30℃±1℃培养8h后，使0.05ug/mL恩诺沙星标准工作液产生14 mm以上清晰、完整的抑菌圈。制备好的平板置2℃～8℃冰箱可保存2 d～3 d。

4.4.4 测定

取制备好的检定用平板两个，在平板底部作好标记，把牛津杯适当间隔置于平板上，每个平板最多不超过6个，在其中一个牛津杯加入280 uL 0.05 ug/mL恩诺沙星标准工作液作为阳性对照，其余的牛津杯中加入280 uL样液，冷藏放置30 min后，30℃±1℃培养8h后开始观察，如果0.05 ug/mL恩诺沙星标准工作液产生清晰、完整的抑菌圈时终止培养，如果无明显抑菌圈，继续观察至24 h。用游标卡尺测量标准工作液和样液的抑菌圈直径大小。每份样品做两个平板上的平行试验。

4.5 结果判断和报告

如样液在平板上无抑菌圈，0.05 ug/mL恩诺沙星标准工作液的抑菌圈大于14 mm，即报告“阴性”。

如样液在平板上呈现抑菌圈，抑菌圈直径在10 mm以上，即报告“初筛阳性”。

如样液在平板上呈现抑菌圈，抑菌圈直径小于10 mm，大于8 mm，或者两个平行结果不一致时，视为可疑，应重新测试后判定。

阳性样品需要用确证方法进行定性及定量分析。

5 检测限

本方法的检测限为：

—恩诺沙星：50 ug/kg；

—环丙沙星：40 ug/kg；

—诺氟沙星：100 ug/kg；

—左氧氟沙星：100 ug/kg；

—氧氟沙星：100 ug/kg；

—达氟沙星：100 ug/kg；

—依诺沙星：200 ug/kg。

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文章来源：《食品化妆品检验卷无机元素和放射元素及其他检测方法》

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